睾丸炎中PK2通过NLRP3炎性小体通路促进IL-1β分泌影响雄性生育力的研究

发布时间：2023-02-26 01:01

　　第一部分UPEC诱导大鼠睾丸巨噬细胞分泌PK2【目的】探究PK2在UPEC诱导的睾丸炎中,在巨噬细胞上的定位及表达情况。【方法】构建UPEC大鼠睾丸炎模型:将细菌悬液由双侧输精管逆行注射,同时用相同方法注入等体积的生理盐水设置对照组。各组大鼠建模7天后,对睾丸进行UPEC基因Pap C及菌落鉴定以确认建模是否成功。电镜检测UPEC在睾丸中的定位情况。分离睾丸巨噬细胞,对细胞内PK2的表达情况进行定位及定量的分析,同时用ELISA检测间质液及细胞培养上清中PK2的表达水平。【结果】各组大鼠处理7天后,感染组睾丸体积较对照组缩小,质量减轻,组织切片内可见生精小管上皮变薄,间质中大量巨噬细胞浸润,精子数量及前向运动率均降低。Pap C基因在对照组中无表达,但可表达于感染组睾丸中。感染组睾丸间质液涂布于平板,次日可见平板上菌落生长,而对照组间质液涂布的平板上无菌落生长。电镜结果显示,对照组大鼠睾丸间质部充盈着丰富的间质液且巨噬细胞数量较少,而感染组的间质中可见大量巨噬细胞浸润,且可观察到UPEC侵入间质区域。免疫荧光结果显示,在对照组中,PK2主要在巨噬细胞的细胞核内表达,而在感染组中,PK2...

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
前言
摘要
ABSTRACT
第一部分 UPEC诱导大鼠睾丸巨噬细胞分泌PK2
    1 前言
    2 材料(对象)与方法
        2.1 主要仪器及试剂
            2.1.1 主要仪器
            2.1.2 主要试剂
        2.2 实验对象及分组
            2.2.1 实验动物
            2.2.2 实验分组
            2.2.3 标本取材
        2.3 主要实验方法
            2.3.1 细菌培养与定量
            2.3.2 UPEC诱导的大鼠睾丸炎模型鉴定
            2.3.3 睾丸组织形态学HE染色
            2.3.4 精液检测
            2.3.5 QRT-PCR检测睾丸巨噬细胞内PK2的MRNA表达水平
            2.3.6 Western blot检测巨噬细胞及上清中PK2 蛋白表达水平
            2.3.7 ELISA检测上清及间质液中PK2 浓度
            2.3.8 免疫荧光检测PK2 在睾丸巨噬细胞内定位情况
            2.3.9 统计分析
    3 结果
        3.1 UPEC睾丸炎大鼠模型鉴定
            3.1.1 大鼠睾丸外观及质量变化
            3.1.2 大鼠睾丸组织学变化情况
            3.1.3 精子质量变化情况
            3.1.4 睾丸组织内UPEC基因鉴定
            3.1.5 睾丸间质液内UPEC鉴定
            3.1.6 UPEC在睾丸内的定位情况
        3.2 PK2 在睾丸巨噬细胞中的表达情况
            3.2.1 PK2 在睾丸巨噬细胞中的定位情况
            3.2.2 PK2 在各组大鼠睾丸巨噬细胞及培养上清的表达情况
        3.3 大鼠睾丸巨噬细胞培养上清及睾丸间质液中PK2 的分泌情况
            3.3.1 体内实验中各组大鼠细胞上清及间质液中PK2 分泌情况
            3.3.2 UPEC体外刺激巨噬细胞分泌PK2 情况
    4 讨论
    5 实验小结
第二部分 PKR-A抑制UPEC诱导的睾丸炎性损伤
    1 前言
    2 材料(对象)与方法
        2.1 主要仪器与试剂
            2.1.1 主要仪器
            2.1.2 主要试剂
        2.2 实验对象及分组
            2.2.1 PKR-A配制
            2.2.2 实验动物及分组
        2.3 主要实验方法
            2.3.1 睾丸组织形态学 HE 染色(同第一部分 2.3.3)
            2.3.2 精液检测(同第一部分 2.3.4)
            2.3.3 血清睾酮水平检测
            2.3.4 流式细胞术检测睾丸巨噬细胞亚型比例
            2.3.5 统计分析
    3 结果
        3.1 睾丸组织形态学HE染色
        3.2 精液常规
        3.3 血清睾酮水平
        3.4 睾丸巨噬细胞亚型比例变化情况
    4 讨论
    5 实验小结
第三部分 PK2 通过促进NLRP3 通路活化促进IL-1β分泌
    1 前言
    2 材料(对象)与方法
        2.1 主要仪器及试剂
            2.1.1 主要仪器
            2.1.2 主要试剂
        2.2 体内实验分组
        2.3 睾丸原代巨噬细胞的分离培养及体外感染/干预模型的构建
            2.3.1 细胞体外感染模型
            2.3.2 PK2 体外干预方法
        2.4 主要实验方法
            2.4.1 ELISA检测睾丸间质液及细胞培养上清中的IL-1β
            2.4.2 Caspase-1 活性检测试剂盒检测细胞内caspase-1 活性的表达
            2.4.3 Western blot检测NLRP3 通路相关因子在不同处理后的变化
            2.4.4 统计分析
    3 结果
        3.1 体内实验
            3.1.1 感染及干预后睾丸间质液中IL-1β的表达变化
            3.1.2 感染及干预后睾丸巨噬细胞caspase-1 活性水平
            3.1.3 感染及干预后睾丸巨噬细胞NLRP3 通路相关因子的表达情况
        3.2 体外实验
            3.2.1 UPEC及外源性PK2 对巨噬细胞分泌IL-1β的影响
            3.2.2 UPEC 及外源性 PK2 对巨噬细胞表达 NLRP3 和 caspase-1 的影响
            3.2.3 NLRP3及caspase-1 抑制剂对睾丸巨噬细胞分泌IL-1β的影响
            3.2.4 NLRP3及caspase-1 抑制剂对巨噬细胞表达NLRP3和caspase-1 的影响
    4 讨论
    5 实验小结
第四部分 睾丸巨噬细胞释放IL-1β抑制睾酮合成
    1 前言
    2 材料(对象)与方法
        2.1 主要仪器及试剂
            2.1.1 主要仪器
            2.1.2 主要试剂
        2.2 实验对象及分组
            2.2.1 原代睾丸间质细胞的分离与培养
            2.2.2 实验分组
        2.3 主要实验方法
            2.3.1 CCK8 试剂盒检测细胞活性
            2.3.2 化学发光法检测间质细胞培养上清中睾酮浓度(同第一部分 2.3.5)
            2.3.3 qRT-PCR 检测间质细胞内睾酮合成相关酶基因表达(同第一部分2.3.6)
            2.3.4 统计分析
    3 结果
        3.1 间质细胞的细胞活性
            3.1.1 不同浓度IL-1β对间质细胞活性的影响
            3.1.2 不同处理的巨噬细胞培养上清对间质细胞活性的影响
        3.2 间质细胞培养上清中睾酮浓度
            3.2.1 不同浓度IL-1β对间质细胞分泌睾酮的影响
            3.2.2 不同处理的巨噬细胞培养上清对间质细胞分泌睾酮的影响
        3.3 间质细胞中睾酮合成相关酶的基因表达情况
            3.3.1 不同浓度IL-1β对间质细胞中睾酮合成相关酶基因表达的影响
            3.3.2 不同处理的巨噬细胞培养上清对间质细胞中睾酮合成相关酶基因表达的影响
    4 讨论
    5 实验小结
全文总结
致谢
参考文献
综述
    参考文献
附录1 攻读博士学位期间发表论文情况
附录2 主要英文缩略词一览表



本文编号：3749506