基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制

发布时间：2023-02-26 04:04

　　目的:观察肝脏自然杀伤细胞在乙肝肝硬化及肝癌临床肝组织样本中的表型变化特点,寻找乙肝肝硬化及肝癌中肝内NK细胞的相关病理分子;体内动物实验比较分析中药扶正化瘀方联合抗病毒药物恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞的免疫调控作用,进一步体内清除NK细胞后,观察联合用药方案对抗乙肝背景肝纤维化药效的影响;体外探讨说明中药扶正化瘀方通过提高NK细胞对HSC的识别杀伤活性,抑制HSC活化的抗肝纤维化的免疫调控机制。本论文分为四个部分。方法:1、收集2017年11月至2018年10月期间在上海交通大学附属仁济医院肝移植中心行外科手术住院患者的肝组织样本以及术前临床基线资料,HE及天狼猩红病理染色观察肝组织炎症及纤维化程度,采用流式细胞术检测各肝组织样本中NK细胞的数量、亚型以及表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的表达,Pearson相关性分析探索NK细胞数量、亚型及表面激活型受体的表达与相应临床基线资料实验室指标之间的相关性,以及其与肝纤维化天狼猩红染色面积参数的相关性,通过免疫组化双重染色技术对激活型NK细胞与活化HSC进行共定位,观察不同组别的共表达差异。2...

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
主要缩略语
中文摘要
ABSTRACT
引言
第一部分 肝脏自然杀伤细胞在乙肝肝硬化及肝癌组织中的表型变化特点
    1 研究对象
        1.1 病例来源
        1.2 纳入标准
        1.3 排除标准
        1.4 分组
    2 观察指标
        2.1 实验室检查
        2.2 肝组织病理检查
        2.3 肝内NK细胞亚型及激活型受体检测
    3 材料
        3.1 主要试剂
        3.2 主要仪器设备
    4 方法
        4.1 组织样本的处理
        4.2 肝组织病理染色
        4.3 肝内NK细胞亚型及表面激活型受体检测
        4.4 石蜡切片免疫组化双重染色
        4.5 统计分析
    5 结果
        5.1 基本资料
        5.2 肝组织病理学观察
        5.3 肝内NK细胞亚型及表面激活型受体的表达特点
        5.4 肝内NK细胞数量、亚型与临床基本资料的相关性分析
        5.5 肝内NK细胞表面激活型受体与临床基本资料的相关性分析
        5.6 肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D的表达与纤维化面积相关性分析
        5.7 肝组织免疫组化双重染色观察肝内NK细胞与活化肝星状细胞的关系
    6 分析与讨论
第二部分 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞的免疫调控作用
    1 材料
        1.1 实验动物
        1.2 药物
        1.3 试剂
        1.4 主要仪器设备
    2 方法
        2.1 实验分组、造模及药物干预
        2.2 样品的采集与处理
        2.3 血清病毒学检测
        2.4 血清肝功能检测
        2.5 肝组织病理染色
        2.6 肝组织羟脯氨酸含量测定
        2.7 石蜡切片免疫组化染色
        2.8 Western Blot蛋白免疫印迹杂交
        2.9 流式细胞术检测细胞表面分子
        2.10 肝组织免疫荧光
        2.11 统计分析
    3 结果
        3.1 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠体重及脏器指数的影响
        3.2 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠病毒学指标的影响
        3.3 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清肝功能的影响
        3.4 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织炎症病理的影响
        3.5 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响
        3.6 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织羟脯氨酸含量的影响
        3.7 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织α-SMA及I型胶原表达的影响
        3.8 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝内淋巴细胞分群的影响
        3.9 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D表达的影响
        3.10 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织RAE-1和Desmin表达的影响
        3.11 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织RAE-1和α-SMA表达的影响
    4 分析与讨论
第三部分 体内清除自然杀伤细胞对扶正化瘀方联合恩替卡韦抗乙肝背景小鼠肝纤维化药效的影响
    1 材料
        1.1 实验动物
        1.2 药物
        1.3 主要试剂及仪器设备
    2 方法
        2.1 实验分组、造模及药物干预
        2.2 样品的采集与处理
        2.3 血清病毒学及肝功能生化检测
        2.4 肝组织病理染色
        2.5 肝组织羟脯氨酸含量测定
        2.6 流式细胞术检测细胞表面分子
        2.7 统计分析
    3 结果
        3.1 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠体重及脏器指数的影响
        3.2 扶正化瘀方联合恩替卡韦对Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞的拮抗作用
        3.3 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清病毒学指标的影响
        3.4 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清肝功能的影响
        3.5 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织炎症病理的影响
        3.6 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响
        3.7 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织羟脯氨酸含量的影响
        3.8 Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞后肝内主要淋巴细胞亚群的变化及扶正化瘀方联合恩替卡韦的干预作用
    4 分析与讨论
第四部分 扶正化瘀方体外调节自然杀伤细胞功能的抗肝纤维化作用机制
    1 材料
        1.1 细胞株
        1.2 药物
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器设备
    2 方法
        2.1 细胞复苏、培养与冻存
        2.2 药物配制
        2.3 药物对细胞的毒性测定
        2.4 Annexin V/7-AAD复染法检测细胞凋亡
        2.5 荧光定量PCR检测mRNA表达
        2.6 流式细胞术检测细胞表面分子
        2.7 ELISA检测细胞因子分泌水平
        2.8 NK92与CFSE-K562细胞共培养杀伤体系的建立及药物评价
        2.9 药物预孵育的NK92与LX-2共培养
        2.10 细胞免疫荧光检测
        2.11 统计分析
    3 结果
        3.1 扶正化瘀方对NK92细胞株和LX-2细胞株的毒性测定
        3.2 扶正化瘀方对NK92细胞株凋亡的影响
        3.3 扶正化瘀方对NK92细胞表面激活型受体表达的影响
        3.4 扶正化瘀方对NK92细胞分泌IFN-γ和Granzyme B水平的影响
        3.5 扶正化瘀方对NK92细胞株杀伤K562功能的影响
        3.6 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后NK92细胞表面激活型受体NKG2D的表达变化
        3.7 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后LX-2细胞表面配体RAE-1的表达变化
        3.8 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后LX-2细胞活化情况
    4 分析与讨论
创新点
结论
致谢
参考文献
附录
    附录1 :文献综述 基于肝脏免疫微环境探讨中西医结合有效逆转乙肝肝纤维化的目标人群特征和作用机制
        参考文献
    附录2 :在校期间发表学术论文
        在校期间发表的学术论文1(首页)
        在校期间发表的学术论文2(首页)
        在校期间发表的学术论文3(首页)
        在校期间发表的学术论文4(首页)
        在校期间发表的学术论文5(摘要)
        在校期间发表的学术论文6(Abstract)
        在校期间发表的学术论文7(Abstract)
    附录3 :参加学术会议及获奖情况



本文编号：3749779