Period2 调节小鼠心肌梗死后血管新生的作用及机制研究

发布时间：2017-05-18 20:06

  本文关键词：Period2 调节小鼠心肌梗死后血管新生的作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景心血管疾病是当今导致人类死亡的第一杀手,其中,急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是心力衰竭、心律失常及猝死的主要原因。AMI发作的一个显著流行病学特点是,多数患者常在凌晨发病,这个时间患者难以及时就诊,因而失去再灌注治疗的最佳时间窗,从而导致较大范围的心肌坏死和心源性休克、心律失常和心力衰竭等严重并发症的发生。因此,深入研究AMI发作的昼夜调控规律及机制,对于有效的防治心肌梗死是具有十分重要的意义的。昼夜节律(circadian rhythm)也被称为近日节律,生理节律,24小时节律,在人体的生理活动中扮演着重要角色,尤其是对组织器官的细胞活性起着节律性的生理调节作用。昼夜节律的破坏会导致疾病的发生、发展。近年来的流行病学研究发现：睡眠剥夺、生理节律被破坏以及夜间处在光环境中的工作者有较大几率发生心肌梗死(myocardial infarction, MⅠ)、中风、糖尿病以及一些癌症,并且有研究还发现节律基因的破坏破坏会产生较少的血管新生。研究表明：心肌梗死的发生相比于其他时间更容易出现在上午6点左右,并且研究还发现凌晨发生的心梗其梗死面积都要明显大于一天当中其他时间。可见,心肌梗死的发生和发展与时间节律有着密切的关系。昼夜节律的交替使得节律基因的转录和翻译呈现出节律性的变化。昼夜节律是通过节律基因调控组织器官功能的。Period 2 (per2)是节律基因period家族成员之一,目前研究认为该基因对心血管疾病有着重要影响。其表达于骨髓CD34阳性细胞、人类的白细胞以及小鼠的骨髓中。研究表明per2通过自身节律性表达调节了造血干细胞的释放。外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的数量和功能与心血管疾病的关系十分密切。外周血内皮祖细胞数量的增加能够改善受损动脉的修复,相反,减少的数量会导致心血管疾病的发生,尤其是心肌梗死的发生发展。2008年,、vang cy等人采用下肢缺血模型研究得出节律基因per2突变会减少下肢缺血后的血管新生,这为节律基因和内皮祖细胞的密切关系提供了有力证据。但对于节律基因per2与心梗发生的节律性以及per2与心梗后的血管新生之间的关系尚缺乏直接的证据。本论文拟通过采用per2基因敲除小鼠研究内皮祖细胞的数量、功能以及这些相关功能与心肌梗死的关系,从而明确节律基因per2在心梗发生发展及血管新生中的作用。目的1.观察野生型小鼠和per2基因敲除(knock out, KO)小鼠外周血内皮祖细胞的数量的变化；2.观察per2基因敲除前后小鼠骨髓内皮祖细胞的功能改变；3.探讨per2基因影响内皮祖细胞的数量和功能的可能机制。方法1小鼠基因型鉴定提取鼠尾组织脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA),加入引物,进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增,并进行DNA琼脂糖凝胶电泳实验进行基因型的鉴定。2动物分组于早6点、中午12点、傍晚18点分别选取野生型(wild type, WT)、per2 KO(per2-／-)小鼠6只,检测外周血内皮祖细胞数量。WT小鼠55只随机分为4组,假手术组10只,心肌梗死模型组心肌内注射盐溶液(PBS)组15只,心梗模型组心肌内注射WT-EPC (MI+WT EPCs)组15只,心梗模型组加心肌内注射per2-/--EPC (MI+per2-/-EPCs)组15只。3内皮祖细胞的分离、培养和鉴定无菌状态下分离小鼠股骨和胫骨,获得单个核细胞,采用EGM-2培养基培养7天,将得到的内皮祖细胞进行流式鉴定及观察细胞对乙酰化低密度脂蛋白(DiI-AcLDL)的摄取和对荆豆凝集素(UEA-I)的绑定进行细胞鉴定。4实时荧光定量PCR检测(Q uantitative RT-PCR)提取内皮祖细胞RNA采用per2引物进行实时定量PCR实验,检测per2的mRNA的表达.5免疫荧光化学检测以免疫荧光方法检测内皮祖细胞上per2的蛋白表达。6内皮祖细胞功能检测(增殖、迁移、粘附、成管功能)采用CCK-8试剂盒检测内皮祖细胞的增殖功能,transwell小室检测内皮祖细胞的迁移功能、基质胶成管实验检测内皮祖细胞体外成管功能、细胞粘附实验检测粘附功能。7蛋白免疫印迹试验检测采用蛋白免疫印迹实验检测内皮祖细胞上P13K/Akt/Foco3a以及(CXCR4的蛋白表达水平。8免疫共沉淀检测通过免疫共沉淀方法检测CXCR4蛋白和per2蛋白的相互作用。9心肌内注射内皮祖细胞的标记采用DiI-C18依据说明书进行内皮祖细胞的标记以备心肌内注射用。10小鼠心梗模型建立使用戊巴比妥钠麻醉小鼠,建立呼吸支持,进行冠状动脉左前降支结扎术。颈部及左前胸脱毛备皮,剪开颈部皮肤,行气管插管。建立有效呼吸支持后,开胸,剪开心包,暴露左冠状动脉前降支。用6-0或7-0的无损缝合线进行冠状动脉结扎,结扎成功后,左心室前壁颜色变白并且室壁运动异常,显示造模成功,然后逐层关胸。11超声学检测术前及术后28天,将异氟烷麻醉的小鼠进行经胸超声心动图检测评估左心室功能。选取频率为35MHz的712型超声探头进行的心脏大小和功能参数的采集,用高分辨率超声Vevo 770系统进行数据分析。探头放置于小鼠左前胸,在心脏乳头肌水平进行M型超声检测,测量舒张末期左心室内径(LVIDd)、收缩末期左室内径(LVIDs).系统自动计算射血分数、短轴缩短率。12组织学检测术后28天处死相应小鼠,使用小鼠左心室冰冻和石蜡切片进行组织学分析。冰冻切片观察DiI的表达。制备5μm石蜡切片行Masson三色染色及免疫组化染色。用Masson染色进行梗死面积测量,使用免疫组化染色法检测相关指标的阳性率。13凋亡检测使用原位末端凋亡检测试剂盒检测梗死周边区细胞的凋亡率,细胞核完全被染色的细胞被认为是凋亡细胞。14统计分析所有统计学数据均使用SPSS 16.0软件分析。计量资料以均数士标准差表示。统计分析两组比较采用t检验、多组比较采用单因素方差分析(one-way ANO VA)方法,先检验方差齐性,若方差齐,使用LSD检验；若方差不齐,使用Dunnett'sT3检验。P0.05被认为有统计学意义。结果1小鼠基因型鉴定结果野生型小鼠琼脂糖凝胶电泳后显像示只有800bp的条带,per2-／-小鼠显像示只有400bp条带,杂合子显像有400bp和800bp两个条带。2野生型小鼠和per2-／-小鼠外周血内皮祖细胞的数量存在显著性差异野生型小鼠外周血内皮祖细胞在6点处于较低水平,12点时升至较高水平,随之下降,18点时较12点有明显下降,但高于6点水平。呈现出节律性变化。而per2-／-小鼠外周血内皮祖细胞的数量的节律性变化消失,在12点和18点时内皮祖细胞数量明显低于野生型小鼠在这两个时间点的数量。3内皮祖细胞被成功分离并培养骨髓来源的单个核细胞在采用EGM-2培养基培养4天即可见集落样细胞铺满培养瓶。7天后,这些细胞能够摄取DiI-AcLDL以及荆豆凝集素,大量细胞表面表达CD34、VEGFR2,少量表达CD45表面标记物。4 Per2 mRNA表达野生型小鼠骨髓来源的内皮祖细胞表达per2的mRNA,而per2-／-小鼠骨髓来源的内皮祖细胞不表达。5 Per2蛋白表达免疫荧光试验检测到野生型小鼠骨髓来源的内皮祖细胞有per2蛋白表达。6两种内皮祖细胞的功能检测结果Per2-／-小鼠骨髓来源的内皮祖细胞的增殖功能、迁移功能、以及成管、粘附功能较野生小鼠明显下降。LY294002 (PI3K信号通路抑制剂)能够抑制野生型内皮祖细胞的增殖功能。采用胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factorIGF-1)刺激per2-／-内皮祖细胞其增殖功能得以恢复,但迁移、成管、粘附功能未恢复。7 PI3K/Akt/Foxo3a 及 CXCR4蛋白表达结果Per2-／-的内皮祖细胞PI3K/Akt/Foxo3a蛋白表达明显受到抑制,CXCR4表达量明显下降,采用IGF-1刺激后PI3K/Akt/Foxo3a的磷酸化表达量有所上调,但CXCR4的表达未发生改变。8 Per2蛋白和CXCR4之间相互作用的检测结果Per2和CXCR4蛋白间存在直接相互作用。9心梗后4周心脏上DiI表达的结果野生型内皮祖细胞治疗组心脏上DiI的数量明显高于Per2-／-内皮祖细胞治疗组,且野生型内皮祖细胞治疗组能明显观察到标记的内皮祖细胞在血管上的表达。10小鼠心梗模型的建立结果成功构建小鼠心梗模型。11超声学检测结果Per2-/-内皮祖细胞治疗组心功能明显低于野生型内皮祖细胞治疗组。12心梗面积及免疫组化检测结果Per2-/-内皮祖细胞治疗组心脏梗死面积明显大于野生型内皮祖细胞治疗组。并且Per2-/-内皮祖细胞治疗组心脏上的凋亡细胞数量明显多于野生型内皮祖细胞治疗组。Per2-/-内皮祖细胞治疗组心脏上的血管新生及动脉新生数量明显少于野生型内皮祖细胞治疗组。结论1.per2基因能够调节小鼠外周血内皮祖细胞数量的节律性变化。2.per2基因能够影响内皮祖细胞的增殖、迁移、成管、粘附功能。3.per2基因通过PI3K/Akt/FoxO3信号通路及CXCR4影响内皮祖细胞的上述功能。4.per2基因能够影响内皮祖细胞心梗后的血管新生。背景在过去的两个世纪中,微血管对于心梗后的康复是非常重要的。人类和动物的实验都证实了心梗后会使得一群来源于骨髓单个核细胞的内皮祖细胞发生动员增加,这群细胞可以分化为内皮细胞并能够归巢到缺血部位产生新的血管并进行组织修复。研究表明：循环内皮祖细胞的数量和功能是进展性的心血管事件以及冠心病预后的重要指征。心梗后大量新生血管的发生及功能的完整化会改善心梗后心脏上的血流,增加心功能,降低左室重塑,减轻心梗带来的危害。目前已证实他汀类降脂药可动员骨髓内皮祖细胞至外周血中,其作用机制主要是通过磷脂酰肌醇-3羟基酶／蛋白激酶B (PI3K/Akt)信号通路实现的。流行病学研究表明：心血管疾病的发生存在着明显的节律性,同时昼夜节律的破坏会导致心血管事件发生率的增加,可见,昼夜节律和心血管事件之间存在着密切关系。我们在第一部分实验中提到,Wang cy等人在2008年研究得出：per2基因突变会使得下肢缺血诱导的内皮祖细胞的血管新生减少。然而,心梗后节律基因调控的骨髓内皮祖细胞的动员及血管新生的研究尚缺乏有力的证据。心肌梗死后心脏上处于一种缺氧的状态,国内外均有研究表明：短暂的缺氧刺激能够增加内皮祖细胞的粘附能力、迁移能力、增殖能力及成管能力。而Per2基因调控缺氧状态下的内皮祖细胞的功能尚缺乏有力的实验研究数据。根据节律基因调控细胞周期和肿瘤生长,Per2基因可能会参与缺血缺氧损伤后骨髓内皮祖细胞功能的改变。我们在前面的实验中已经充分证实Per2对内皮祖细胞功能的重要性,但对心梗后Per2对骨髓内皮祖细胞的动员及缺氧状态下内皮祖细胞功能的改变尚未进行研究,因此我们在这一部分提出下面的假说：Per2基因可能通过某些机制参与了心梗后的骨髓内皮祖细胞的动员；Per2可能通过某些机制对缺氧后内皮祖细胞的功能改变有着相关的调节作用。目的1体内实验观察Per2对心肌梗死后外周血内皮祖细胞的动员情况；2体内实验观察Per2调节血管新生在缺血心脏中的表达情况；3体外实验观察Per2对骨髓来源内皮祖细胞在缺氧状态下的迁移、成管功能的影响；4探索Per2增强缺氧状态下骨髓来源内皮祖细胞的迁移、成管功能的机制。方法1.动物分组及心梗模型建立将48只野生型小鼠及40只Per2-/-小鼠分别分为对照组和心梗模型组。采用结扎左冠状动脉前降支造成心梗模型。2.超声学检测于术前及梗死后28天行超声学检测,在心脏乳头肌水平进行M型超声检测,测量舒张末期左心室内径(LVIDd)、收缩末期左室内径(LVIDs)。由系统自动算出左室射血分数、左室短轴缩短率。3.外周血内皮祖细胞数量的动员检测于心梗后3天采用心尖取血方式获得外周血,孵育流式抗体,检测心梗后小鼠骨髓内皮祖细胞的动员数量。4.骨髓微环境检测于心梗后3天,获得小鼠骨髓单个核细胞,裂解提取蛋白,进行蛋白免疫印迹实验,观察Akt及ERK的磷酸化水平。5.组织病理学检测心梗后28天,麻醉小鼠,获取小鼠心脏组织,进行甲醛灌注固定、组织脱水、浸蜡切片。制备5μm石蜡切片用于Masson三色染色及免疫组化染色。使用Masson染色计算左心室梗死百分比；使用免疫组化染色法检测相关指标的阳性率。6.细胞培养及鉴定分离小鼠骨髓单个核细胞,采用EGM-2培养基进行诱导培养。7天后进行内皮祖细胞的相关鉴定。7.细胞在缺氧状态下的功能学检测将培养7天的内皮祖细胞进行transwell小室迁移实验及基质胶成管实验,上述实验于缺氧状态下进行。8.蛋白免疫印迹实验检测将培养7天的内皮祖细胞进行缺氧诱导培养24小时,提取蛋白,进行蛋白免疫印迹实验,进而检测相关信号通路在缺氧后的表达情况。9.数据分析数据以均数士标准误表示。用SPSS 16.0软件做统计分析。两组间比较采用T检验。多组间比较使用单因素方差分析(one-way ANO VA)方法,检验方差是否齐性,若数据方差齐,使用LSD检验；若数据方差不齐,使用Dunnett's T3检验。P0.05被认为有统计学意义。结果1.小鼠模型建立情况成功构建小鼠心肌梗死模型。2.超声学对心功能检测的结果心梗后28天,per2-／-小鼠心功能明显低于野生型小鼠心功能。3.外周血内皮祖细胞心梗后动员情况心梗后3天,两组小鼠相对于对照组外周血内皮祖细胞数量均有明显上升,但per2-／-小鼠外周血中内皮祖细胞动员的比例明显低于野生型小鼠。4.骨髓微环境检测结果心梗后3天,野生型小鼠相对于对照组骨髓Akt及ERK出现明显磷酸化,但per2-／-小鼠骨髓上述信号通路的磷酸化不明显。5.心梗面积及心脏上内皮祖细胞及血管新生检测结果心梗后28天,per2-／-小鼠心梗面积明显大于野生型小鼠,心脏上内皮祖细胞数量及新生血管数量却明显少于野生型小鼠。6.内皮祖细胞的培养及鉴定结果于培养7天后成功获得内皮祖细胞,这些细胞能够摄取乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素。同时大多数细胞外膜能够表达CD3、CD31及VEGFR2。7.细胞缺氧状态下功能检测结果缺氧状态下,Per2-/-抑制了缺氧诱导的内皮祖细胞的功能激活,使得敲除基因后的内皮祖细胞的迁移及成管功能明显低于野生型小鼠的内皮祖细胞。8.蛋白免疫印迹实验相关机制的检测结果缺氧能够增加野生型小鼠内皮祖细胞的Per2蛋白表达,并能激活P13K／Akt信号通路,但Per2-/-抑制了该信号通路的激活,从而可能通过该信号通路抑制了缺氧状态下的内皮祖细胞的功能。结论1.Per2基因能够调节小鼠心梗后的骨髓内皮祖细胞的动员；2.Per2基因通过调节内皮祖细胞的动员及缺氧状态下的功能进而影响心肌梗死后心脏上的血管新生；3.Per2基因可能通过调节P13K/Akt信号通路影响缺氧状态下的内皮祖细胞的功能。
【关键词】：period 2基因 心肌梗死 血管新生 内皮祖细胞 内皮祖细胞动员 缺氧 period 2基因 心肌梗死 血管新生
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22
【目录】：

• 论文I 节律基因period 2调节内皮祖细胞的功能在心肌梗死中的作用6-84
• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-17
• 符号说明17-20
• 前言20-23
• 材料和方法23-49
• 实验结果49-51
• 讨论51-61
• 结论61
• 创新点和限制性61-62
• 附表62-63
• 附图63-70
• 参考文献70-84
• 论文2 节律基因Period 2对小鼠也肌梗死后缺氧诱导的骨髓内皮祖细胞动员和功能的作用及机制研究84-132
• 中文摘要84-88
• 英文摘要88-92
• 符号说明92-94
• 前言94-95
• 材料方法95-117
• 讨论117-120
• 创新点和限制性120-121
• 结论121-122
• 附图122-128
• 参考文献128-132
• 致谢132-133
• 攻读博士学位期间发表SCI论文133-134
• 附件134-135
• SCI论文1135-162
• SCI论文2162-184

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