右美托咪定对未成熟大鼠异氟醚暴露致大脑神经损伤的保护作用

发布时间：2017-05-18 20:16

  本文关键词：右美托咪定对未成熟大鼠异氟醚暴露致大脑神经损伤的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着妊娠早期诊断和治疗技术的发展,临床上妊娠非产科手术日益增多,近年来更开展了胎儿子宫外手术和胎儿镜手术。这些类型的手术大多数在妊娠的第二阶段进行。无论手术接受者是母体还是胎儿,此类手术均需对母体实施全身麻醉,以获得母体和胎儿的麻醉效应,吸入全身麻醉为最常用的麻醉方式。在麻醉过程中,为了避免子宫收缩和降低早产的风险,吸入性全麻药常需维持较高的最低肺泡有效浓度(Minimum alveolar concentration, MAC) (1.5-2MAC),以松弛子宫平滑肌。因吸入性全麻药为亲脂性,短时间内即可通过胎盘屏障,与母体的药物分布达到平衡,使胎儿未成熟大脑处于高浓度的全麻药环境。这种因临床需要所造成的被动药物暴露,使胎儿包括大脑在内的神经系统可能面临发育异常的威胁。妊娠第二阶段是胎儿神经系统发育的重要阶段,是大脑开始发育的时期,包含神经形成、神经元迁移及皮层发生等重要的神经发育步骤,此阶段也是大脑神经突触的快速生长阶段。胎儿神经发育对环境和药物影响敏感。因此该时期如遇全麻药物暴露,可导致细胞凋亡介导的神经退行性变,延缓神经发育和突触发生及造成突触丢失,增大胎儿神经异常发育的风险。同时,这种神经损伤效应,可在短期内即出现并具有长期的影响。全麻药所致神经发育损伤具体可表现在几个方面：①较长时间全麻药物暴露后,通过免疫组化方法可观察到大脑海马区组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific protease, Caspase)-3增高,提示大脑出现异常神经元凋亡；②于该类胎鼠成年期进行行为学试验,可观察到其学习记忆能力下降及情绪改变；③该类胎鼠成年期,通过透射电镜观察其大脑海马区组织的超微结构,可见其突触数量减少及基底膜发育不良。大脑神经元异常凋亡现象是最先观察到的全麻药物损伤效应。细胞凋亡是发育过程中的正常现象,指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡。神经细胞凋亡在大鼠发育阶段正常存在,起清除多余的和已完成使命的神经细胞,保证大脑正常发育的作用。当正常的凋亡过程被干扰时,大脑的发育进程即可出现异常。临床上多种全麻药物,如静脉全麻药苯二氮卓类药物、巴比妥类药物、氯胺酮、丙泊酚和依托咪酯；吸入全麻药异氟醚、七氟醚、地氟醚和氧化亚氮,均可影响未成熟大脑神经元的凋亡进程,从而使大脑的发育发生改变。全麻药致神经元凋亡异常增加不仅在啮齿类动物上予以证实,且多个物种的动物研究均支持这一结果,包括灵长目动物。肾上腺素旺2受体(α2-adrenergic receptor,α2-AR)的激动,在生命早期的神经发育中起重要的作用。大鼠从妊娠第12天龄始至出生后短期内的大脑发育,α2-AR表达增加伴随着神经元发育进程,在第19、20天增加速度达最高峰。激动剂与α2-AR的结合能促进神经发育。右美托眯定是高选择性α2-AR激动剂,同时也具有显著神经保护作用,在数种脑损伤模型中业已证实。右美托咪定与每一种α2-AR亚型均有高度亲和力,其中与α2A-AR亚型的结合是发挥神经保护作用的主要途径。右美托咪定可增加脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达,从而引发级联反应的保护作用。BDNF属于神经营养因子家族。在哺乳类动物中,神经营养因子的作用呈综合性,在支持神经元存活、分化和突触生长中起重要作用,由神经释放,其合成和分泌均依赖于神经元的兴奋。其中BDNF具有促进神经元存活、调节中枢神经系统突触发育和突触可塑性、调节神经递质的释放等作用,在全麻药暴露神经损伤中是重要作用位点,可观察到其表达的抑制。因伦理等因素限制,目前关于全麻药对人类胎儿、新生儿、儿童的大脑发育影响的研究甚少,故对人类是否出现这种神经损伤仍难以定论。但全麻药对人类未成熟大脑损伤的可能性,仍是增加社会问题和增加医疗资源消耗的潜在威胁。随着上述手术的增加,母亲/胎儿不可避免需接受全麻药,迫切需要研究如何才能减轻或避免此种损伤,以利于提高第二妊娠阶段中期的非产科手术或胎儿手术全身麻醉的安全性。此研究方向能响应国家优生优育政策,也有利于减少人类社会问题和降低未来医疗成本。本课题通过不同浓度异氟醚作用于母体,确定可引发胎鼠神经损伤的浓度；通过不同剂量复合应用右美托咪定,探讨右美托咪定有效作用的剂量和方法；采取行为学方法评价异氟醚对胎鼠的神经损伤和右美托咪定的保护作用；通过透射电镜(Tansmission electron microscopy, TEM)观察大脑超微结构,及采用免疫组化实验检测BDNF及突触素(Synaptophysin, Syn),探讨其可能的作用机制。旨在探索右美托咪定有效减轻胎儿期全麻药神经损伤的方法和剂量,为临床应用提供理论依据。第一章不同浓度异氟醚长时间吸入致妊娠中期胎鼠大脑异常凋亡目的模拟妊娠中期妇女非产科手术的临床麻醉,对妊娠第14天母鼠进行长时间吸入异氟醚麻醉,观察不同浓度的异氟醚对胎儿神经系统的影响。方法实验对象为50只定时受孕的SD雌性大鼠,以及其各自的胎鼠。母鼠定时受孕,至妊娠第14天,母鼠随机分为5组： Iso1.0组、Iso1.5组、Iso2.0组,Oxy组和Control组,每组10只。Iso1.0组、Iso1.5组、Iso2.0组母鼠分别自主吸入1.0%、1.5%、2.0%异氟醚及100%氧气混合气体4h, Oxy组单纯吸入100%氧气4h,Control组不作任何处置。吸入气体结束4h后,母鼠使用水合氯醛麻醉,行剖宫取胎术。每只母鼠随机选择2个孕囊,分离出胎鼠,4%多聚甲醛固定后于距额部2mm处取大脑组织切片。TUNEL法检测胎鼠神经细胞凋亡量,计算凋亡细胞数与总细胞数的比率。实验室数据采集使用盲法进行,同母2只胎鼠数据取平均值纳入统计,数据资料以均数±标准差(i±s)表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。不同处理组之间比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD法,取P值为0.05,P0.05认为差异具有显著统计学差异。结果各组间凋亡细胞比率有显著性差异(F=8.113,P0.001)。与Control组比较,吸入异氟醚的各组,即Iso1.0组、Iso1.5组和Iso2.0组,凋亡细胞比率均呈升高,具有显著性统计学意义(P0.05)；而Oxy组与Control组相似(P0.05)。与Iso2.0组比较,Iso1.5组与其相似(P0.05)；Control组、Oxy组呈显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)；Iso1.0组显著低于Iso2.0组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论1.妊娠第14天,母鼠持续吸入1%、1.5%、2%三种浓度异氟醚4h,胎鼠大脑神经元均可于4h后凋亡显著增加。2.母鼠吸入异氟醚致胎鼠大脑神经元凋亡增加作用可能存在剂量依赖性。3.母鼠吸入纯氧4h并不增加4h后胎鼠大脑神经元凋亡。第二章不同剂量右美托咪定对异氟醚致妊娠中期胎鼠神经元异常凋亡的保护作用目的评价应用右美托咪定对妊娠第14天胎鼠长时间异氟醚暴露所致神经损伤是否具有保护作用,以及探讨其可能的机制。方法实验对象为70只定时受孕的SD雌性大鼠,以及其各自的胎鼠。母鼠定时受孕,至妊娠第14天,母鼠被随机分为7组：Dex5+Iso组、Dex10+Iso组、Dex20+Iso组、NS+Iso组、Dex20+Yoh+Iso组、Dex20+Oxy组、Control组,每组10只。注射药物：Dex5+Iso组、Dex10+Iso组、Dex20+Iso组、Dex20+Oxy组母鼠分别于相应吸入气体前15min、吸入气体2h时腹腔内注射右美托咪定5rtg/kg、10μg/kg、20μg/kg、20μg/kg; Dex20+Yoh+Iso组于相同时间点同部位注射右美托咪定20μg,/kg、育亨宾500μg/kg; NS+Iso组则注射等量生理盐水；Control组未做任何处理。吸入气体：Dex5+Iso组、Dex10+Iso组、Dex20+Iso组、NS+Iso组、Dex20+Yoh+Iso组母鼠自主吸入1.5%异氟醚及100%氧气混合气体4h；Dex20+Oxy组吸入100%氧气4h；Control组未做任何处理。吸入气体结束4h后,母鼠使用水合氯醛麻醉,行剖宫取胎术。每只母鼠随机选择2个孕囊,分离出胎鼠,4%多聚甲醛固定后于距额部2mm处取大脑组织连续切片。TUNEL法检测胎鼠神经细胞凋亡量,计算凋亡细胞数与总细胞数的比率。免疫组化方法检测大脑BDNF、Syn表达水平,计算单位面积平均光密度(Mean optical density,MOD)值。实验室数据采集使用盲法进行,同母2只胎鼠数据取平均值纳入统计,数据资料以x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。不同处理组之间比较使用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,取P值为0.05,P0.05认为差异具有显著统计学差异。结果各组间凋亡细胞比率有显著性差异(F=6.145, P0.001), Dex10+Iso组、Dex20+Iso组及Dex20+Oxy组与Control组相似(P0.05)；Dex5+Iso组虽高于Control组,但差异未有显著性统计学意义(P0.05); NS+Iso组、Dex20+Yoh+Iso组则显著升高(P0.05)。与NS+Iso组比较,Dex10+Iso组、Dex20+Iso组、Dex20+Oxy组及Control组均呈显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)；Dex5+Iso组虽低于NS+Iso组,但差异未有显著性统计学意义(P0.05);Dex20+Yoh+Iso组与NS+Iso组相似(P0.05)。与Dex20+Yoh+Iso组比较,Dex5+Iso组、Dex10+Iso组及Dex20+Iso组均显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。各组间BDNF表达MOD值也有显著性差异(F=6.015, P0.001)。Dex10+Iso组、Dex20+Iso组及Dex20+Oxy组与Control组相似(P0.05);Dex5+Iso组、NS+Iso组、Dex20+Yoh+Iso组则呈显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与NS+Iso组比较,Dex10+Iso组、Dex20+Iso组、Dex20+Oxy组及Control组均显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)；而Dex5+Iso组、Dex20+Yoh+Iso组与其相似(P0.05)。与Dex20+Yoh+Iso组比较,Dex10+Iso组及Dex20+Iso组均显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);Dex5+Iso组与其相似(P0.05)。各组胎鼠大脑的Syn表达MOD值相接近,差异无统计学意义(F=1.130,P=0.356)。结论1.应用右美托咪定10μg/kg、20μg/kg两种剂量进行预处理和吸入中追加给药,可减少子宫内胎鼠1.5%异氟醚暴露4h所致神经元异常凋亡作用。2.右美托咪定通过激动α2-AR起神经保护作用,此作用可被育亨宾所拮抗。3.右美托咪定的神经保护作用可能存在剂量依赖性。4.右美托咪定可上调胎鼠大脑BDNF表达,BDNF上调产生的级联反应可能参与右美托咪定的神经保护作用。5.子宫内胎鼠1.5%异氟醚暴露4h,无论是否复合使用右美托咪定,均未观察Syn表达显著改变。6.单独使用右美托咪定不引起胎鼠大脑凋亡增加,对BDNF、Syn表达无影响。第三章右美托咪定对子宫内胎鼠异氟醚暴露神经保护作用至大鼠成年期的影响目的通过行为学实验,评价应用右美托咪定对妊娠第14天胎鼠长时间异氟醚暴露所致胎鼠神经损伤的保护作用是否延续至成年期,并以解剖学和免疫组化方法探讨其可能的机制。方法实验对象为50只定时受孕的SD雌性大鼠,以及其各自的雄性子鼠。母鼠定时受孕,至妊娠第14天,母鼠被随机分为5组：Dex+Iso组、NS+Iso组、Dex+Yoh+Iso组、Dex+Oxy组、Control组,每组10只。注射药物：Dex+Iso组、Dex+Oxy组母鼠分别于相应吸入气体前15min、吸入气体2h时腹腔内注射右美托咪定20pμg/kg; Dex+Yoh+Iso组于相同时间点同部位注射右美托咪定201μg/kg、育亨宾500μg/kg; NS+Iso组则注射等量生理盐水；Control组未做任何处理。吸入气体：Dex+Iso组、NS+Iso组及Dex+Yoh+Iso组母鼠自主吸入1.5%异氟醚及100%氧气混合气体4h, Dex+Oxy组在相同空间内吸入100%氧气4h,Control组未做任何处理。每窝子鼠出生后与其母鼠同笼,母乳喂养至出生21天,与母鼠分离并饲料喂养。至出生后第56天,每窝同母子鼠随机选择雄性2只,按其母鼠所属分组,行为学实验后分别行电镜分析及免疫组化实验。所有动物行为学实验前均行视觉障碍排除。先行旷场实验(Open-field test, OFT),记录其自主活动距离、平均速度、排便次数；再行Morris水迷宫实验(Morris water maze test, MWM),实验前4天为定向航行实验,记录大鼠从东南(SE)象限入水后寻找隐藏平台的潜伏期时间,实验第5天为隐匿平台寻找实验,记录首次穿越原平台位置的时间及穿越该位置的次数。行为学实验结束后,拟行电镜分析子鼠腹腔内注射水合氯醛麻醉,于冰面上取其大脑海马CA1区组织行透射电镜分析,于13500倍镜下,记录突触计数；于46000倍镜下,观察突触形态,并测量突触间隙和突触后致密物厚度。拟行免疫组化实验子鼠腹腔内注射水合氯醛麻醉,经心脏灌注固定液后解剖取大脑组织进行免疫组化实验,分别检测Syn、BDNF的表达程度,计算其MOD值。行为学数据及实验室数据使用盲法采集,同母2只子鼠行为学实验数据取其平均值纳入统计。计量资料以x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件分析。Morris水迷宫实验中第1天至第4天的潜伏时间使用重复测量资料方差分析,使用LSD法进一步行组间比较；其余数据使用单因素方差分析,组间比较使用LSD法,P0.05认为差异具有统计学意义。结果旷场实验中,各组子鼠活动距离和平均速度无统计学差异(F=0.339,P=0.850;F=0.393,P=0.812)。各组子鼠间大便次数有显著差异(F=5.203,P=0.002),Dex+Iso组与Dex+Oxy组及Control组相似(P0.05),显著少于NS+Iso组(P0.05)；而Dex+Yoh+Iso组则和NS+Iso组相似(P0.05),显著高于Control组(P0.05); Dex+Iso组大便次数虽低于Dex+Yoh+Iso组,但差异未有显著统计学意义(P0.05)。Morris水迷宫中,大鼠前4天行定向航行实验,各组大鼠潜伏期时间于不同天数间有显著差异(F=99.348,P0.001),于第1天最高,第4天最低；各组于第1、2天潜伏期时间相似(F=0.211, P=0.931; F=0.155, P=0.960),于第3、4天有显著差异(F=2.957, P=0.030; F=4.173, P=0.006)。进一步对同一天内组间数据行两两比较,可见第3天,Dex+Iso组与其余各组均无显著性差异(P0.05); Dex+Yoh+Iso组则与NS+Iso组相似(P0.05),显著高于Control组(P0.05); Dex+Oxy组和Control组相似(P0.05),显著低于NS+Iso组(P0.05)。第4天,Dex+Iso组、Dex+Oxy组与Control组相似(P0.05),显著低于NS+Iso组；Dex+Yoh+Iso组与NS+Iso组相似(P0.05),显著高于Control组(P0.05); Dex+Iso组显著低于Dex+Yoh+Iso组(P0.05)。第5天行单次隐匿平台寻找实验,可见各组子鼠首次穿越平台位置时间和穿越次数有显著差异(F=3.124, P=0.024; F=4.146, P=0.006), Dex+Iso组、Dex+Oxy组首次穿越平台位置时间和Control组相似(P0.05),显著低于NS+Iso组(P0.05); NS+Iso和Dex+Yoh+Iso组显著高于Control组(P0.05)；Dex+Iso组显著低于Dex+Yoh+Iso组(P0.05)。Dex+Iso组、Dex+Oxy组穿越次数和Control组相似(P0.05),显著多于NS+Iso组(P0.05); NS+Iso和Dex+Yoh+Iso组显著少于Control组(P0.05); Dex+Iso组显著多于Dex+Yoh+Iso组(P0.05)。电镜分析结果,各组大鼠突触个数有显著差异(F=15.771,P.001)。Dex+Iso组、Dex+Oxy组与Control组相似(P0.05),均显著多于NS+Iso组(P0.05);而NS+Iso组和Dex+Yoh+Iso组相似(P0.05),均显著低于Control组(P0.05)。Dex+Iso组显著多于Dex+Yoh+Iso组(P0.05)。各组子鼠突触间隙宽度及突触后致密物厚度无统计学差异(F=0.119, P=0.975; F=0.638, P=0.638)。免疫组化实验结果,各组间Syn表达MOD值有显著差异(F=4.590,P=0.003), Dex+Iso组、Dex+Oxy组和Control组相似(P0.05),显著高于NS+Iso组(P0.05)；而NS+Iso和Dex+Yoh+Iso组显著低于Control组(P0.05);Dex+Iso组显著高于Dex+Yoh+Iso组(P0.05)。各组大鼠BDNF表达MOD值无统计学差异(F=0.363,P=0.834)。结论1.应用右美托咪定20μg/kg进行预处理和吸入中追加给药,可对1.5%异氟醚暴露4h的子宫内妊娠第14天雄性子鼠产生长期影响,表现在：①可减少因子宫内异氟醚暴露所致成年期焦虑情绪上升、空间学习记忆能力下降等行为异常。②可减轻成年期大脑海马CA1区的突触数量下降及Syn表达下降。2.右美托咪定对空间学习记忆能力的保护作用,及对突触数量、Syn表达的保护作用,均可被育亨宾所拮抗。3.单独应用右美托咪定对雄性子鼠成年期行为、突触数量及Syn表达水平无显著改变。
【关键词】：右美托咪定 异氟醚 神经保护 胎鼠 凋亡 突触
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R614
【目录】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-27
• 前言27-37
• 参考文献31-37
• 第一章 不同浓度异氟醚长时间吸入致妊娠中期胎鼠大脑异常凋亡37-57
• 1 材料与方法37-42
• 2 结果42-46
• 3 讨论46-50
• 4 结论50
• 参考文献50-57
• 第二章 不同剂量右美托咪定对妊娠中期胎鼠异氟醚暴露致神经异常凋亡的保护作用57-82
• 1 材料与方法57-63
• 2 结果63-70
• 3 讨论70-75
• 4 结论75-76
• 参考文献76-82
• 第三章 右美托咪定对子宫内胎鼠异氟醚暴露神经保护作用至大鼠成年期的影响82-115
• 1 材料与方法83-90
• 2 结果90-107
• 3 讨论107-110
• 4 结论110-111
• 参考文献111-115
• 全文总结115-116
• 综述116-131
• 参考文献124-131
• 中英文缩略词对照表131-132
• 攻读学位期间成果132-133
• 致谢133-136
• 学位论文统计合格证明136

  本文关键词：右美托咪定对未成熟大鼠异氟醚暴露致大脑神经损伤的保护作用，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：377068