前列腺上皮组织特征维持及分子调控机制的研究

发布时间：2023-04-05 15:39

　　目的:前列腺组织主要由两种类型上皮细胞组成,基底和管腔上皮细胞,两者存在一定的相似性,同时又存在多种因素在两者特异的表型方面参与调控及维持。本论文旨在:(1)研究前列腺基底上皮细胞特征是如何维持的?该过程需要哪些调控因子参与?(2)研究管腔上皮细胞特征是如何维持的?前列腺管腔上皮组织的三大属性,细胞间连接、细胞极性和细胞分裂轴定位三者之间存在怎样的相互作用?方法:通过开展一系列体内体外实验考察上皮间质转化(EMT)转录调控因子在前列腺上皮组织中的表达模式及生物学功能,利用高通量单细胞RNA测序分析及体内实验检测Zeb1表达上皮细胞中富集哪些相关信号通路调节因子来维持基底上皮干细胞亚群的干性、EMT特征和基底细胞的正常发育。通过开展一系列体内体外实验考察细胞间连接蛋白E-cadherin在前列腺上皮组织中的表达模式和黏附连接缺陷小鼠的表型。通过转录组测序分析和生化实验研究管腔上皮细胞特征维持的主要因素细胞间黏附连接蛋白E-cadherin,Scribble细胞极性蛋白复合物及LGN分裂纺锤体定位复合物三者之间的相互关系。所有的统计学检验均为双侧检验。结果:(1)上皮间质转化核心转录因子Z...

【文章页数】：218 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
绪论
    1.1 研究背景
    1.2 存在的科学问题
    1.3 研究技术路线
    1.4 科学意义
第一部分 前列腺基底干细胞维持基底上皮细胞特征和正常发育
    第一章 引言
        1.1 上皮组织概述
        1.2 基底上皮细胞特征维持中的EMT机制及分裂模式
        1.3 EMT特征维持的信号通路
    第二章 实验材料与操作方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验动物及人组织样本
            2.1.2 实验试剂
            2.1.3 实验仪器耗材
        2.2 实验操作方法
            2.2.1 小鼠基因型鉴定
            2.2.2 原代细胞获得及细胞流式分选
            2.2.3 细胞甩片及免疫荧光染色
            2.2.4 冰冻切片及免疫荧光染色
            2.2.5 石蜡切片及其H&E染色
            2.2.6 质粒抽提实验
            2.2.7 病毒制备及目的细胞感染
            2.2.8 类器官培养及功能检测
            2.2.9 泌尿生殖窦间质细胞分离及培养
            2.2.10 原代前列腺上皮细胞分离及肾包膜移植实验
            2.2.11 谱系示踪实验
            2.2.12 单细胞RNA测序和数据分析
            2.2.13 实时定量聚合酶链式反应
            2.2.14 蛋白免疫印迹
            2.2.15 统计学分析
    第三章 实验结果
        3.1 发现EMT转录因子表达的前列腺上皮细胞
        3.2 高通量单细胞RNA-seq发现Zeb1⁺前列腺上皮细胞群
            3.2.1 获得前列腺基底上皮单细胞
            3.2.2 获得高质量单细胞RNA测序数据
            3.2.3 单细胞RNA-seq数据分析得到Zeb1⁺基底上皮细胞亚群
        3.3 Zeb1⁺上皮细胞与前列腺上皮组织之间的相关性研究
            3.3.1 成功构建Zeb1 荧光报告小鼠
            3.3.2 Zeb1 在前列腺上皮细胞中的分布及表达模式
        3.4 Zeb1⁺前列腺基底上皮细胞的生物学功能研究
            3.4.1 体外Zeb1⁺基底上皮细胞类器官形成实验
            3.4.2 体内Zeb1⁺基底上皮细胞肾包膜移植实验
            3.4.3 体内谱系示踪Zeb1⁺基底上皮细胞多向分化的命运
            3.4.4 Zeb1 保证基底上皮细胞正常发育
        3.5 Wnt信号通路正向调控Zeb1⁺基底上皮细胞
            3.5.1 单细胞RNA-seq数据显示Zeb1⁺基底上皮细胞富集Wnt信号通路
            3.5.2 qRT-PCR实验结果支持单细胞RNA-seq数据分析结果
            3.5.3 APCmin模型小鼠中Zeb1⁺基底上皮细胞比例显著增多
        3.6 研究模型图及小结
    第四章 实验结论、讨论及展望
        4.1 实验结论
        4.2 讨论和展望
        4.3 科学意义
第二部分 细胞连接、细胞极性和细胞分裂轴定位共同维持前列腺管腔上皮细胞的组织特征
    第一章 引言
        1.1 上皮细胞极性的建立及维持
            1.1.1 上皮细胞极性组成-PAR complex
            1.1.2 上皮细胞极性组成-Scribble complex
            1.1.3 上皮细胞三种极性蛋白复合物之间的互作及应用
        1.2 上皮细胞间连接的建立及功能
        1.3 细胞分裂模式基础知识
            1.3.1 细胞分裂模式相关分子调控机制
            1.3.2 细胞分裂模式研究的应用
    第二章 实验材料与操作方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验动物、细胞系、质粒
            2.1.2 实验试剂
            2.1.3 实验仪器耗材
        2.2 实验操作方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 石蜡切片及其免疫组织化学染色
            2.2.3 细胞增殖
            2.2.4 细胞实时示踪实验
            2.2.5 内源性免疫共沉淀
            2.2.6 GST-pull down实验
    第三章 实验结果
        3.1 黏附连接蛋白集中表达及分布在成年小鼠前列腺管腔上皮细胞间
            3.1.1 qRT-PCR结果显示黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间
            3.1.2 免疫荧光染色结果表明黏附连接蛋白集中分布在前列腺管腔上皮细胞间
        3.2 黏附连接E-cadherin缺失促进前列腺管腔上皮细胞增殖能力及肿瘤发生发展
            3.2.1 体外E-cadherin表达下调促进前列腺上皮细胞增殖能力
            3.2.2 E-cadherin前列腺特异性敲除小鼠模型构建及表型探究
        3.3 黏附连接蛋白E-cadherin表达缺失导致细胞分裂轴定位异常
            3.3.1 体外黏附连接蛋白表达下调严重影响细胞分裂轴正确定位
            3.3.2 体内黏附连接缺陷造成管腔上皮细胞分裂轴偏转随机化
            3.3.3 体外黏附连接蛋白表达下调显著减弱蛋白LGN-NUMA的结合能力
            3.3.4 体内黏附连接缺失导致LGN蛋白复合物细胞膜分布异常
        3.4 黏附连接蛋白E-cadherin丢失导致细胞极性蛋白复合物弥散分布
            3.4.1 体外敲低黏附连接蛋白表达水平显著削弱蛋白DLG-SCRIB的结合能力
            3.4.2 体内黏附连接缺失造成细胞极性蛋白复合物分布异常
        3.5 考察细胞连接、细胞极性和分裂轴定位三者间的互作及分子机制
            3.5.1 RNA-seq分析结果支持细胞连接、极性和分裂轴定位之间存在紧密互作
            3.5.2 增殖活跃的E-cadherin蛋白表达缺失的管腔上皮细胞更易发生肿瘤转化
            3.5.3 E-cadherin/SCRIB/LGN三元复合物的形成维持前列腺管腔上皮组织结构
        3.6 研究模型图及小结
    第四章 实验结论、讨论及展望
        4.1 实验结论
        4.2 讨论和展望
        4.3 科学意义
全文总结
    1.1 研究总结
    1.2 研究创新性
    1.3 科学意义
致谢
参考文献
攻读博士学位期间已发表或录用的论文



本文编号：3783674