miR-30b-5p与miR-148a-3p抑制自噬-溶酶体通路及其作用机制的探索
发布时间：2023-04-08 02:32
巨自噬(以下统称为自噬)是维持细胞内动态平衡的一种基本生理过程,它通过降解一些错误折叠的蛋白质以及衰老损伤的细胞器使得细胞能够抵抗饥饿与药物损伤等外界刺激。自噬与神经退行性疾病、心血管疾病以及肿瘤等诸多疾病密切相关。自噬体与溶酶体的融合是自噬通路中的一个重要环节,自噬底物最终通过溶酶体内的酸性水解酶进行降解,因此溶酶体的生成对于自噬过程至关重要。microRNA(miRNA)是一类内源性的小分子非编码RNA,其长度约为22个核苷酸,能够通过多种作用机制参与调控人体内60%以上的基因。近年来,有诸多研究发现miRNA能够通过靶向于不同的自噬溶酶体相关基因调节自噬过程,但是在这些研究中miRNA均是在细胞质中通过经典的分子机制发挥作用,对于细胞核中miRNA的作用几乎没有研究。本课题旨在探索miR-30b-5p与miR-148a-3p分别通过细胞核与细胞质内的不同作用方式调控溶酶体的生成与自噬过程,为阐述miRNAs新的作用机制以及治疗自噬异常相关疾病提供了新的思路。1.细胞核中的miR-30b-5p抑制TFEB所介导的溶酶体生成及自噬:(1)miR-30b-5p可以与CLEAR元件直接结...
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1 miRNA简介
1.1.1 miRNA的生成与经典调控作用
1.1.2 miRNA的亚细胞定位和入核机制
1.1.3 miRNA在细胞核内的作用
1.2 .自噬简介
1.2.1 自噬概述
1.2.2 自噬过程
1.3 .转录因子TFEB
1.3.1 TFEB的功能
1.3.2 TFEB的核转运过程
1.4 .miRNA调节与自噬及疾病之间的关系
1.4.1 miRNA对自噬的调节作用
1.4.2 miRNA通过调节自噬治疗疾病
1.5 科学问题与研究意义
第2章 细胞核中的miR-30b-5p抑制TFEB所介导的溶酶体生成及自噬
2.1 .前言
2.2 实验材料
2.2.1 细胞株
2.2.2 实验动物
2.2.3 抗体
2.2.4 试剂与试剂盒
2.2.5 主要仪器与耗材
2.2.6 引物
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 细胞转染
2.3.3 质粒构建
2.3.4 蛋白质印记法
2.3.5 RNA提取,cDNA合成与荧光实时定量PCR
2.3.6 MiRNA提取、反转录与荧光实时定量PCR
2.3.7 荧光素酶检测技术
2.3.8 CRISPR/Cas9 基因敲除
2.3.9 染色质免疫沉淀技术
2.3.10 Pull down实验
2.3.11 细胞核与细胞质分离提取RNA/蛋白
2.3.12 免疫荧光实验
2.3.13 荧光原位杂交实验
2.4 实验结果
2.4.1 筛选与CLEAR元件相结合的候选miRNA
2.4.2 miR-30b-5p能够直接与CLEAR元件相结合
2.4.3 miR-30b-5p通过CLEAR元件与溶酶体相关基因的启动子区结合并抑制其转录
2.4.4 细胞核中的miR-30b-5p能够影响TFEB的转录活性
2.4.5 miR-30b-5p不会与TFEB直接结合或者影响其入核
2.4.6 miR-30b-5p抑制细胞中溶酶体的生成
2.4.7 miR-30b-5p对于溶酶体生成的抑制作用是在细胞核中发生的
2.4.8 miR-30b-5p抑制自噬体的生成以及自噬流的形成
2.4.9 内源性的miR-30b-5p抑制自噬溶酶体过程
2.4.10 miR-30b-5p抑制自噬溶酶体过程是由TFEB所介导的
2.4.11 小鼠肝脏中miR-30b-5p对于自噬溶酶体过程的调节
2.5 小结与讨论
第3章 miR-148a-3p通过直接与CTSA结合而抑制自噬
3.1 前言
3.2 实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 细胞培养与转染
3.3.2 质粒构建
3.3.3 考马斯亮蓝染色
3.3.4 质谱分析
3.3.5 质粒小量抽提
3.3.6 质粒中量抽提
3.3.7 质粒转化
3.3.8 核酸胶回收
3.3.9 PCR产物纯化
3.3.10 基因点突变
3.4 实验结果
3.4.1 生物信息学及qPCR实验发现miR-148a-3p是 CTSA的负调控因子
3.4.2 miR-148a-3p能够抑制CTSA蛋白及mRNA的表达
3.4.3 miR-148a-3p能够抑制溶酶体生成以及自噬过程
3.4.4 miR-148a-3p不影响TFEB的转录活性
3.4.5 miR-148a-3p不会影响转录因子TFEB的表达
3.5 小结与讨论
第4章 结论与展望
4.1 结论
4.2 创新点
4.3 展望
参考文献
缩略词表
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
本文编号：3785822
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1 miRNA简介
1.1.1 miRNA的生成与经典调控作用
1.1.2 miRNA的亚细胞定位和入核机制
1.1.3 miRNA在细胞核内的作用
1.2 .自噬简介
1.2.1 自噬概述
1.2.2 自噬过程
1.3 .转录因子TFEB
1.3.1 TFEB的功能
1.3.2 TFEB的核转运过程
1.4 .miRNA调节与自噬及疾病之间的关系
1.4.1 miRNA对自噬的调节作用
1.4.2 miRNA通过调节自噬治疗疾病
1.5 科学问题与研究意义
第2章 细胞核中的miR-30b-5p抑制TFEB所介导的溶酶体生成及自噬
2.1 .前言
2.2 实验材料
2.2.1 细胞株
2.2.2 实验动物
2.2.3 抗体
2.2.4 试剂与试剂盒
2.2.5 主要仪器与耗材
2.2.6 引物
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 细胞转染
2.3.3 质粒构建
2.3.4 蛋白质印记法
2.3.5 RNA提取,cDNA合成与荧光实时定量PCR
2.3.6 MiRNA提取、反转录与荧光实时定量PCR
2.3.7 荧光素酶检测技术
2.3.8 CRISPR/Cas9 基因敲除
2.3.9 染色质免疫沉淀技术
2.3.10 Pull down实验
2.3.11 细胞核与细胞质分离提取RNA/蛋白
2.3.12 免疫荧光实验
2.3.13 荧光原位杂交实验
2.4 实验结果
2.4.1 筛选与CLEAR元件相结合的候选miRNA
2.4.2 miR-30b-5p能够直接与CLEAR元件相结合
2.4.3 miR-30b-5p通过CLEAR元件与溶酶体相关基因的启动子区结合并抑制其转录
2.4.4 细胞核中的miR-30b-5p能够影响TFEB的转录活性
2.4.5 miR-30b-5p不会与TFEB直接结合或者影响其入核
2.4.6 miR-30b-5p抑制细胞中溶酶体的生成
2.4.7 miR-30b-5p对于溶酶体生成的抑制作用是在细胞核中发生的
2.4.8 miR-30b-5p抑制自噬体的生成以及自噬流的形成
2.4.9 内源性的miR-30b-5p抑制自噬溶酶体过程
2.4.10 miR-30b-5p抑制自噬溶酶体过程是由TFEB所介导的
2.4.11 小鼠肝脏中miR-30b-5p对于自噬溶酶体过程的调节
2.5 小结与讨论
第3章 miR-148a-3p通过直接与CTSA结合而抑制自噬
3.1 前言
3.2 实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 细胞培养与转染
3.3.2 质粒构建
3.3.3 考马斯亮蓝染色
3.3.4 质谱分析
3.3.5 质粒小量抽提
3.3.6 质粒中量抽提
3.3.7 质粒转化
3.3.8 核酸胶回收
3.3.9 PCR产物纯化
3.3.10 基因点突变
3.4 实验结果
3.4.1 生物信息学及qPCR实验发现miR-148a-3p是 CTSA的负调控因子
3.4.2 miR-148a-3p能够抑制CTSA蛋白及mRNA的表达
3.4.3 miR-148a-3p能够抑制溶酶体生成以及自噬过程
3.4.4 miR-148a-3p不影响TFEB的转录活性
3.4.5 miR-148a-3p不会影响转录因子TFEB的表达
3.5 小结与讨论
第4章 结论与展望
4.1 结论
4.2 创新点
4.3 展望
参考文献
缩略词表
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
本文编号：3785822
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