基于化痰法探讨皂荚提取物对肝癌大鼠microRNA表达的影响

发布时间：2017-05-19 17:12

  本文关键词：基于化痰法探讨皂荚提取物对肝癌大鼠microRNA表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本课题前期研究发现中药化痰药皂荚具有明显抗肝癌的作用,皂荚提取物能够明显调控肝癌细胞TGF-β/Smads信号系统以及PTEN/PI3K/AKT信号通路。我们推测皂荚提取物可能通过调节其相关micro RNAs表达来调控相关信号分子,从而发挥抗肝癌的作用。在前期研究的基础上,我们通过理论和实验研究,选择与之相关的micro RNAs及靶基因进行验证。进一步阐明该药治疗肝癌的分子机制,为中药皂荚开发及临床应用提供科学依据。方法:第一部分理论研究1.中医药防治肝癌的历史悠久,在肝癌的病情进展中痰瘀互结贯穿于疾病始终,化痰法是治疗肝癌的重要治法,也应贯彻肝癌治疗的始终。2.说明中药化痰药皂荚的价值、特点及古今临床应用。并阐述皂荚提取物具有抗肝癌作用的前期研究依据。3.随着分子生物学对肝癌的研究进展,肝癌分子靶向治疗是当今临床研究最为活跃的领域之一,在中医药理论指导下,结合现代分子生物学技术,阐明中医药防治肝癌的机制,是中医药对肝癌防治的发展方向,也有助于发现肝癌治疗的新靶点。第二部分实验研究1.Walker-256移植性肝癌大鼠模型的建立取出储存Walker-256癌细胞株的冻存管,立即放进37℃水浴槽中,等待完全融化过后,再将其取出,并于无菌的环境下进行细胞悬液吹打,然后转移细胞悬液到15ml离心管中。稍微晃动离心管,逐渐加入PBS缓冲液到8ml为止。然后以每分钟1000转的速度离心离心管10min,去除上清液,用PBS缓冲液冲洗2次。然后以4ml PBS缓冲液进行细胞重悬,将细胞悬液收入5ml注射器,再将其注入5只Wistar大鼠腹腔,每只注入1ml。每天观察大鼠腹部膨隆情况,20天后形成癌性腹水。将上述Wistar大鼠腹腔内的红色洗肉水样癌性腹水用注射器抽出15ml,放入离心机内以每分钟2000转的速度离心2min,离心后去除上层清液体,保留下层粘稠的浓缩液体,用PBS缓冲液冲洗3次,制备细胞悬液备用,密度为2 x107/ml。将65只约200g左右的SD大鼠按体重平均分为6组,即空白组、模型组、皂荚提取物高剂量组,皂荚提取物中剂量组,皂荚提取物低剂量组及索拉非尼组,每组10只。另外5只作为验证造模而备用。实验手术前大鼠禁食12小时,将模型组、皂荚提取物高剂量组,皂荚提取物中剂量组,皂荚提取物低剂量组及索拉非尼组分别按40μg/100g体重水合氯醛腹腔内麻醉,将大鼠以仰卧位固定在鼠板上,然后以0.5%活力碘腹部消毒,用手术剪沿腹白线剪开腹部皮肤,接着逐层分离,使大鼠腹腔暴露,即可以看到肝脏膨出。选择最外层的肝叶,用注射器抽取1ml癌性腹水细胞悬液,以45度将注射器斜刺入所选肝叶内,深度约0.5cm,0.15ml细胞悬液缓缓推送注射器注入制备的癌性腹水,立即拔出注射器针头,用消毒棉签按压穿刺点一直到不出血为止,将肝脏还纳入腹腔内,常规缝合关闭腹腔,红霉素软膏擦拭消毒伤口。为证实造模成功,所有53只大鼠造模完毕后,在造模后第7天,在其中随机挑选3只,另外12只正常大鼠中挑选2只,取出大鼠肝脏,观察病理切片。2.处理措施根据人临床用量(皂荚生药量1.5g.70kg.d-1),给药剂量根据参考文献,人与大鼠体表面积折算的等效剂量计算为实验灌胃剂量(折算系数如下表,人体平均体重标准为70kg,大鼠平均体重标准为200g),按1:2:4设置皂荚提取物低剂量组(128.57mg.kg.d-1)、中剂量组(257.14mg.kg.d-1)和高剂量组(514.28mg.kg.d-1);索拉非尼:68.57mg/kg/d(索拉非尼成人0.8g/d,按人与小鼠体表面积折算的等效剂量计算);空白组给予0.9%生理盐水10 ml/kg/d;模型组:建立肝癌模型后,给药同空白组;各组灌胃给药量均为相同体积;移植后1周后开始治疗;各组连用28d。终止治疗时间为移植后35d。将需取材大鼠行颈推脱臼处死,在无菌条件下,消毒后进行开腹,空白组选取大鼠组织结构完整的部分做肝脏标本;经过造模的大鼠,选取肝脏内癌组织,如有肝癌结节者,尽量取最大的部分;将取出组织用滤纸吸干后留存,将待检测组织分组处理,切成范围为1cm×1cm,厚0.2cm的组织块,连续切片,用甲醛乙醇混合液对其进行固定3小时,然后自动脱水固定,用于HE染色及Tunel细胞凋亡检测大鼠肝脏病理切片的制作。3.实验方法实验一:观察各组大鼠组织病理切片的形态学改变;用TUNEL细胞凋亡检测技术观察各组组织中细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率,进行统计学分析。实验二:用Real-time PCR检测技术检测各组大鼠组织中mi R-21、mi R-181b、mi R-183的表达量,进行统计学处理。实验三:用Western-blot检测法和Real-time PCR检测法,检测各组大鼠组织中,PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4蛋白和m RNA的表达量,通过统计学处理,对比分析。结果:实验一皂荚提取物对肝癌大鼠病理组织形态的影响1.从形态学角度观察正常组中肝小叶结构清晰完整,细胞胞浆胞核均匀,肝细胞索排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列。胞核较大,位于肝细胞中央,整个状态均一。肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润,无纤维组织增生。而模型组中肝小叶失去正常结构,大部分肝小叶被肿瘤组织代替,周边的肝小叶受压质地变实,肝窦扩张,肝血窦周围可见纤维组织增生。汇管区明显增宽,有大量的成纤维细胞、纤维细胞。肿瘤细胞呈圆形,再生活跃,异型性明显,细胞核染色变深,核质比变大,部分出现核固缩和核碎裂现象,肿瘤细胞呈团块状分布,有的部分出现凝固性坏死,染色呈深红色。将皂荚提取物低剂量组的病理切片和模型组相比,虽然可见肝小叶失去正常结构,一部分肝小叶被肿瘤组织取代;但细胞形态有些许的改善,不过依然出现很严重的核固缩现象,核质比很大,部分细胞呈团块状。肝窦扩张,肝血窦周围有纤维组织增生。皂荚提取物中剂量组相对于模型组来看,有较大程度的改善,可明显看出肝小叶的结构有了一定的恢复,肿瘤组织、异型性细胞数量和过塑细胞数量减少,核质比较大的细胞数量也明显减少。肝血窦周围偶尔可见到纤维组织增生。皂荚提取物高剂量组中,从形态上看肝小叶结构基本清晰完整,细胞胞浆胞核均匀,大部分肝小叶细胞正常,部分细胞有核固缩和异型性的现象,但是相较于模型组,状态改善很明显。肝血窦周围很少见到纤维组织增生。索拉菲尼组的形态学较模型组改变最为明显,并且最接近于正常组,肝小叶结构基本清晰完整,细胞胞浆胞核均匀,肝细胞索排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列。胞核较大,位于肝细胞中央,整体分布较均一。肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润,基本没有纤维组织增生。与正常组相比,有很少部分细胞的形态出现异型性,无团状分布现象。2.采用TUNEL细胞凋亡检测技术,观察6组切片的细胞凋亡情况,每组取4个视野,显微镜下组织切片上凋亡的细胞为棕褐色,图像分析系统定量分析肝癌细胞的凋亡指数。通过ANOVA检测,P=0.000,P0.01,n=24,六组间比较有显著性差异,各组间两两比较,皂荚提取物组与索拉非尼组比较,P=0.274,P0.05,差异无统计学意义。其余各组间均有显著性差异(P=0.000,P0.01)。实验二皂荚提取物对肝癌大鼠mi RNA的影响1.通过Real-time PCR检测肝癌细胞中mi R-21的表达水平。通过单因素方差分析,6组mi R-21的表达量有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间两两比较,除皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.975,P0.05)。其余各组间均有显著性差异(P0.01)。2.通过Real-time PCR检测肝癌细胞中mi R-181b的表达水平。通过单因素方差分析,6组mi R-181b的表达量有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间两两比较,除皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.954,P0.05)。其余各组间均有显著性差异(P0.01)。3.通过Real-time PCR检测肝癌细胞中mi R-183的表达水平(见表4和图7)。通过单因素方差分析,6组mi R-183的表达量有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间两两比较,除皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较有统计学差异(P=0.023,P0.05)。其余各组间均有显著性差异(P0.01)。实验三皂荚提取物对肝癌大鼠PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4 m RNA和蛋白的影响1.分别应用QRT-PCR和Western blot检测肝癌大鼠组织中PTEN m RNA和蛋白的表达水平,通过单因素方差分析,6组中PTEN m RNA和蛋白的表达水平均有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间PTENm RNA两两比较,皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.365,P0.05)。各组间PTEN蛋白两两比较,模型组和皂荚提取物低剂量组比较(P=0.011,P0.05),皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.076,P0.05),其余各组间均有显著性差异(P0.01)。2.检测肝癌大鼠组织中TIMP-3 m RNA和蛋白的表达水平,通过单因素方差分析,6组中TIMP-3 m RNA和蛋白的表达水平均有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间TIMP-3 m RNA两两比较,皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.064,P0.05)。各组间TIMP-3蛋白两两比较,皂荚提取物中剂量组和皂荚提取物低剂量组比较(P=0.017,P0.05),皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.054,P0.05),其余各组间均有显著性差异(P0.01)。3.检测肝癌大鼠组织中MMP2 m RNA和蛋白的表达水平,通过单因素方差分析,6组中MMP2 m RNA和蛋白的表达水平均有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间MMP2 m RNA两两比较,模型组和皂荚提取物低剂量组相比有统计学差异(P=0.015,P0.05),皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.996,P0.05)。各组间MMP2蛋白两两比较,空白组与索拉非尼组相比有统计学差异(P=0.04,P0.05),模型组和皂荚提取物低剂量组比较(P=0.036,P0.05),皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.129,P0.05),其余各组间均有显著性差异(P0.01)。4.肝癌大鼠组织中MMP9 m RNA和蛋白的表达水平,通过单因素方差分析,6组中MMP9 m RNA和蛋白的表达水平均有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间MMP9 m RNA两两比较,模型组和皂荚提取物低剂量组相比有统计学差异(P=0.032,P0.05),皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.859,P0.05)。各组间MMP9蛋白两两比较,空白组与索拉非尼组相比有统计学差异(P=0.035,P0.05),模型组和皂荚提取物低剂量组比较(P=0.015,P0.05)、低剂量组和中剂量组比较(P=0.013,P0.05)差异有统计学意义,皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(P=0.189,P0.05),其余各组间均有显著性差异(P0.01)。5.检测肝癌大鼠组织中PDCD4 m RNA和蛋白的表达水平,通过单因素方差分析,6组中PDCD4 m RNA和蛋白的表达水平均有显著性差异(P=0.000,P0.01)。各组间PDCD4 m RNA两两比较,模型组和皂荚提取物低剂量组相比有统计学差异(P=0.025,P0.05),其余各组间两两比较均有显著性差异(P0.01)。各组间PDCD4蛋白两两比较均有显著性差异(P0.01)。结论:1.皂荚提取物能够诱导Walker-256移植性大鼠肝癌细胞凋亡,具有显著的抗肝癌效应,其中以高剂量组效果最明显,与索拉非尼无明显差异。2.皂荚提取物在诱导大鼠肝癌细胞凋亡的过程中,可下调肝癌细胞中mi R-21,同时上调抑癌基因PTEN基因和蛋白的表达;还能够使mi R-181b下调,同时影响TIMP3(基质金属蛋白酶抑制因子3)/MMP2(基质金属蛋白酶2)/MMP9(基质金属蛋白酶9)系统;还可以下调mi R-183,同时上调其靶目标-抑癌基因PDCD4(程序性细胞凋亡因子4),其中以高剂量组的效果最显著,与索拉非尼组没有明显差异。3.通过皂荚提起物能够调控mi RNA及其相应靶基因的表达,进一步验证了皂荚提取物促进肝癌细胞的凋亡的作用机理,也进一步验证了皂荚提取物的多靶点抗癌效应。
【关键词】：皂荚提取物 肝癌 microRNAs PTEN TIMP3/MMP2/MMP9 PDCD4 索拉非尼
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要5-12
• Abstract12-22
• 英文缩略词表22-23
• 前言23-25
• 第一部分 理论研究25-37
• 一、中国古代防治肝癌的历史溯源25-29
• 1. 中医对肝癌病名的认识25-26
• 2. 中医治疗肝癌的历史经验26-29
• 二、现代医学对肝癌的认识及研究进展29-33
• 1. 现代医学对肝癌研究的历史沿革29-32
• 2. 现代医学对肝癌治疗的研究进展32-33
• 3. 中医药治疗肝癌的优势与方向33
• 三、从痰论治肝癌的理论基础33-35
• 四、中药化痰药皂荚的研究35-37
• 第二部分 实验研究37-89
• 实验一 皂荚提取物对移植性肝癌大鼠抗癌效应的实验研究37-51
• 一、引言37-38
• 二、材料与方法38-44
• 1. 实验材料38-40
• 2. 实验方法40-44
• 三、结果44-49
• 四、小结49-51
• 实验二 皂荚提取物对肝癌大鼠miRNA的影响51-66
• 一、引言51
• 二、材料与方法51-61
• 1. 实验材料51-53
• 2. 实验方法53-61
• 三、结果61-65
• 四、小结65-66
• 实验三 皂荚提取物对肝癌大鼠PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4 mRNA和蛋白的影响66-89
• 一、引言66
• 二、材料与方法66-79
• 1. 实验材料66-69
• 2. 实验方法69-79
• 三、结果79-87
• 四、小结87-89
• 讨论89-94
• 1. 皂荚提取物在抗肝癌效应中下调肝癌细胞中miR-21,上调PTEN的表达90-91
• 2. 皂荚提取物在抗肝癌效应中下调肝癌细胞中miR-181b,调控TIMP-3/MMPs系统91-92
• 3. 皂荚提取物通过下调肝癌细胞中miR-183,上调PDCD92-94
• 结论94-95
• 参考文献95-103
• 问题与展望103-104
• 综述 肝癌分子生物学研究进展104-115
• 参考文献110-115
• 附图115-120
• 在读博士期间,发表的论文和参与的课题120-121
• 致谢121

  本文关键词：基于化痰法探讨皂荚提取物对肝癌大鼠microRNA表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：379275