体液miRNA作为生物标志物在疾病诊断治疗中的应用及miR-203通过靶向SRC影响肺癌细胞增殖、迁移和凋亡

发布时间：2017-05-20 05:14

  本文关键词：体液miRNA作为生物标志物在疾病诊断治疗中的应用及miR-203通过靶向SRC影响肺癌细胞增殖、迁移和凋亡，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：miRNA是一种广泛存在于真核生物体内的短小RNA分子,长度约16-22nt。可以通过与mRNA序列互补阻遏蛋白翻译,从而调控蛋白表达进而影响生物学功能。自1993年被发现以来,miRNA越来越受到科研工作者的广泛关注,目前已经证实,miRNA在细胞分化、增殖、凋亡,生物体发育及多种生物学过程中都起着非常重要的调控作用。而不仅是生理状态,miRNA在多种疾病的发生发展过程中起到的作用也在近年来进行了广泛而深入的探索。而随着血清中稳定存在的miRNA的发现,血清miRNA表达谱作为生物标志物用于多种肿瘤及重大疾病的诊断也成了该领域中近年来的一大热点。其实,不仅是血清,人的其他体液如尿液、汗液、唾液等中同样存在稳定表达的miRNA。因此这些miRNA在某些特定条件下也有望成为很好的诊断标志物。本文旨在以干扰素治疗乙肝疗效预测及肾损伤的诊断为例研究体液miRNA作为分子标志物在临床诊断上的应用以及以miR-203靶向于SRC蛋白为例研究miRNA在肺癌发生发展中的作用。乙型肝炎是一种分布极广的传染性疾病,因此慢性乙肝的治疗也因其受众广、难治愈、易复发而成为医学界的一个难题。除传统医学的中草药外,目前明确有效成分的临床应用乙肝治疗药物主要有核苷类似物和干扰素两种。前者是针对病毒复制而设计的药物,短期抗病毒效果好,副作用小,但长期使用容易产生耐药,易复发；后者作为一种经典的抗病毒药物,通过调节自身免疫达到抗病毒的目的,其疗效稳定,不易复发,不会产生耐药,但其疗效与个体差异关系较大,仅有40%左右的人群使用该药物有效,且其副作用较大。因此,对于干扰素来说,用药前的疗效预测非常重要。此部分研究旨在研究血清miRNA作为生物标志物用于干扰素a治疗乙肝病人的疗效预测,以期为临床用药提供参考。课题组在前人的基础上,尝试寻找一种用于预测干扰素治疗乙肝疗效的特征性miRNA表达谱。我们收集了108例干扰素治疗前的乙肝病人血清,并通过跟踪其治疗后的血液生化指标将其分为有效组和无效组。运用microRNA array高通量筛选出两组差异表达的miRNA,再以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证芯片结果。我们发现,miR-99a作为血清的分子标志物,对干扰素疗效的预测的ROC曲线下面积可达0.74,有望作为临床干扰素治疗乙肝的分子标志物。除血清外,人的其他体液中也有稳定存在的miRNA,但以这些体液作为生物标志物的研究尚少。而尿液作为一种更方便收集的体液,收集过程对患者无损伤、且与肾脏关系密切,因此是肾病诊断的理想媒介。肾病的发生往往伴随着肾损伤,轻度肾损伤由于症状较轻往往不易察觉,从而成为重大肾病的隐患。因此肾损伤的早期诊断很重要。目前临床肾损伤的诊断采用的主要是以肌酐、尿量为指标的诊断标准,但这两者均受多种因素影响,缺乏特异性,并且难以制定一个统一的客观标准。因此寻找一个敏感特异的肾脏早期损伤的生物标志物对肾损伤进行早期预测,以便于及时采取有效手段进行治疗显得极为必要。此部分旨在筛选出理想的尿液miRNA作为肾损伤标志物,以期为临床肾损伤的诊断提供参考。我们通过缺血再灌注以及链脲霉素(streptozotocin, STZ)分别对小鼠进行造模,以模拟急性和慢性肾损伤,并用组织切片病理学对造模结果进行了鉴定。通过实时荧光定量PCR手段,我们筛选了组织特异性miRNA,我们发现miR-10a和miR-30d能够作为肾损伤的标志物,并且比临床所用的血尿氮更为灵敏。接下来我们检测了局段节灶性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)的病人尿液与正常人尿液,发现miR-10a和miR-30d在病人尿液中有明显升高,进一步验证miR-10a和miR-30d的确可以作为良好的肾损伤标志物。miRNA除了可以作为稳定的生物标志物,在肿瘤的发生发展过程中也起了非常重要的作用。肺癌是世界范围肿瘤相关性死亡的主要病因,其死亡率居恶性肿瘤死亡率之首。目前的治疗方法主要是以手术治疗、放射治疗和药物治疗为主。有效的抗肿瘤药物的开发一直是科学界的焦点。Src蛋白是一种非受体酪氨酸蛋白激酶,由原癌基因c-Src编码,在肿瘤的发生、发展和转移中具有重要作用,体外实验表明抑制Src对肺癌患者有效。我们通过生物信息学方法,寻找到miR-203可以靶向于Src蛋白的3'非翻译区(Untranslated region, UTR)的四个结合位点。同时我们收集了6对肺癌和正常肺组织标本,检测了Src蛋白、mRNA和miR-203的表达情况,发现在肺癌组织中,Src蛋白显著上升、mRNA没有显著变化,而miR-203明显降低。并且Src蛋白的表达量与miR-203呈现皮尔森负相关。接着我们用荧光素酶(Luciferase)实验验证了miR-203对SRC的直接靶向作用,并用细胞功能实验验证了miR-203可以抑制肺癌细胞的迁移和增殖,并促进其凋亡。
【关键词】：miRNA 乙型肝炎 干扰素α 肾损伤 肺癌 SRC
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62;R734.2
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 第一章 绪论12-45
• 1.1 microRNA概述12-15
• 1.1.1 microRNA的体内生成12-13
• 1.1.2 植物microRNA与动物microRNA13
• 1.1.3 microRNA的生理特性13
• 1.1.4 血清microRNA作为生物标志物的发现13-14
• 1.1.5 miRNA与肿瘤14-15
• 1.1.6 microRNA作为抗癌药物的潜力15
• 1.2 乙型肝炎概述15-21
• 1.2.1 乙肝的流行病学15-16
• 1.2.2 乙肝的传播16-17
• 1.2.3 乙肝带来的问题17
• 1.2.4 乙型肝炎病毒基因组17
• 1.2.5 乙型肝炎病毒的血清存在形式17-18
• 1.2.6 乙型肝炎病毒的抗逆性18-19
• 1.2.7 乙型肝炎病毒的生活史19
• 1.2.8 乙型肝炎病毒的变异19-20
• 1.2.9 乙型肝炎的药物治疗20-21
• 1.3 肾损伤概述21-30
• 1.3.1 肾脏的解剖结构21
• 1.3.2 肾单位21-22
• 1.3.3 肾脏功能检验指标22-23
• 1.3.4 肾损伤23-26
• 1.3.5 肾损伤的标志物26-28
• 1.3.6 尿液miRNA作为生物标志物预测肾损伤的优势28-30
• 1.4 肺癌概述30-41
• 1.4.1 肺癌的病因30-31
• 1.4.2. 肺癌的治疗31-33
• 1.4.3 几种重要的抗肿瘤药物靶点33-38
• 1.4.4. Src蛋白38-41
• 参考文献41-45
• 第二章 血清miRNA用于干扰素α治疗乙肝病人的疗效预测45-68
• 2.1 引言45-46
• 2.2 仪器与试剂46-47
• 2.2.1 耗材46
• 2.2.2 主要试剂46-47
• 2.2.3 主要仪器47
• 2.3 实验方法47-50
• 2.3.1 样本的收集47
• 2.3.2 病人的生化指标的采集及样本的分组47-48
• 2.3.3 低密度芯片检测48
• 2.3.4 样品初筛和复筛48-50
• 2.3.5 数据分析50
• 2.4 实验结果50-54
• 2.4.1 低密度芯片结果50
• 2.4.2 水背景排除50-51
• 2.4.3 样本初筛51-52
• 2.4.4 样本复筛52-53
• 2.4.5 病人血生化指标53
• 2.4.6 ROC曲线与散点图53-54
• 2.5 结果讨论54-57
• 附：低密度芯片结果57-67
• 参考文献67-68
• 第三章 尿液miR-10a和miR-30d作为新型灵敏、特异的生物标志物用于肾损伤的早期诊断68-84
• 3.1 引言68-69
• 3.2 材料和方法69-70
• 3.2.1. 实验材料69-70
• 3.2.1.1 实验动物69
• 3.2.1.2 实验器材69-70
• 3.3 实验方法70-73
• 3.3.1 小鼠缺血再灌注实验(renal ischemia-reperfusion injury,IRI)70
• 3.3.2 链脲霉素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病肾损伤模型70
• 3.3.3 组织切片及组织学染色70-71
• 3.3.4 尿液RNA的提取71-72
• 3.3.5 正常人与FSGS病人尿液与血液样本的收集72-73
• 3.4 实验结果73-80
• 3.4.1 miR-10a和miR-30d作为肾脏特异性miRNA73-75
• 3.4.2 肾损伤后小鼠尿液中肾脏特异性miRNA含量升高75-79
• 3.4.3 局段节灶性肾小球硬化(FSGS)病人的尿液中miR-10a和miR-30d的含量升高79-80
• 3.5 实验讨论80-83
• 参考文献83-84
• 第四章 miR-203通过靶向SRC抑制肺癌细胞的增殖和迁移,并促进凋亡84-111
• 4.1 引言84
• 4.2 材料和方法84-95
• 4.2.1. 实验材料84-86
• 4.2.2. 实验方法86-95
• 4.3 实验结果95-107
• 4.3.1 在肺癌组织中,SRC的蛋白上调,mRNA不变95-97
• 4.3.2 miR-203可以靶向于SRC的3'UTR区97-99
• 4.3.3 肺癌组织中miR-203与SRC的含量呈负相关99-100
• 4.3.4 SRC是miR-203的直接靶点100-104
• 4.3.5 miR-203通过靶向SRC影响A549细胞的增殖、迁移和凋亡104-107
• 4.4 实验讨论107-110
• 参考文献110-111
• Publications111-113
• 致谢113-115

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张洁;王鸿程;;Src及其抑制剂对非小细胞肺癌作用的研究进展[J];国际内科学杂志;2009年01期

  本文关键词：体液miRNA作为生物标志物在疾病诊断治疗中的应用及miR-203通过靶向SRC影响肺癌细胞增殖、迁移和凋亡，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：380752