质子感知GPCRs对MEF细胞迁移的影响

发布时间：2017-05-21 14:06

  本文关键词：质子感知GPCRs对MEF细胞迁移的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本项研究首次针对胞外酸性环境对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)信号通路的影响及其分子机制进行较全面的研究。胞外酸性环境已被报道能够在多种细胞中通过活化存在于细胞膜表面的质子感知G蛋白偶联受体或是离子通道,激活多条胞内信号通路,调节细胞功能。通过这种调控机制,胞外酸性环境在癌症、哮喘等多种疾病的发生、发展中发挥重要作用。因此,研究胞外酸性对不同类型细胞的信号通路的影响及其分子机制将会领引我们发现更多新的治疗疾病的靶标,为相关疾病的治疗和药物开发提供科学依据。本研究分别采用野生型C57BL/6小鼠来源的MEF细胞,TDAG8TP/TP,OGR1geo/geo和GPR4基因敲除C57BL/6小鼠来源的MEF细胞作为研究对象。运用细胞迁移、细胞存活率测定、细胞内钙离子浓度测定等实验方法检测胞外酸性环境对于MEF细胞信号通路的影响。采用Real-Time PCR技术检测四种质子感知的G蛋白偶联受体(OGR1、 GPR4、TDAG8和G2A) mRNA在野生型MEF细胞中的表达水平。Western blotting被用于检测在野生型MEF中,OGR1、GPR4、TDAG8和G2A的蛋白表达量及胞外酸性刺激MEF细胞后,细胞迁移相关信号通路中的Aktl和p38MAPK蛋白的磷酸化水平,探讨胞外酸性诱导MEF细胞迁移的胞内信号通路。借助SPSS13.0软件进行实验组和对照组之间的单因素方差分析(ANOVA)和分别来源于野生型小鼠,TDAG8TP/TP, OGR1geo/geo和GPR4基因敲除小鼠的MEF细胞迁移数理论值和实际值之间的配对t检验。P0.05为具有显著性差异。本项研究首先检测胞外酸性环境对MEF细胞迁移的影响及对不同生长因子(IGF-1、EGF和PDGF)诱导的MEF细胞迁移的影响。细胞迁移实验结果显示,胞外酸性促进MEF细胞的迁移,且特异性地增力PDGF诱导的MEF细胞的迁移。随后,本研究进一步检测胞外酸性对MEF细胞存活力和增殖的影响,探寻上述实验结果是否与MEF细胞存活力和增殖的改变相关。MTT实验和BrdU实验结果显示,在PDGF存在或是不存在的情况下,胞外酸性均抑制MEF细胞的存活力和增殖,提示胞外酸性促进MEF细胞的迁移及促进PDGF诱导的MEF细胞的迁移通过质子感知机制。抑制剂实验揭示,无论PDGF存在与否,百日咳毒素(PTX),一种Gi蛋白特异性抑制剂,完全抑制胞外酸性诱导的细胞迁移,而YM254890,一种Gq蛋白的特异性抑制剂,未能抑制胞外酸性促进的MEF细胞的迁移,提示Gi蛋白,而不是Gq蛋白,参与胞外酸性促进的细胞迁移和胞外酸性促进的PDGF诱导的细胞迁移。Western blotting实验结果显示,在PDGF存在或不存在的情况下,与pH 7.6饥饿培养基相比,pH 6.8饥饿培养基刺激MEF细胞后,磷酸化的P38MAPK蛋白表达明显增强。为了验证胞外酸性促进PDGF诱导的细胞迁移是否是PDGF诱导的细胞迁移和胞外酸性诱导细胞迁移的加性效应,我们分析了本研究中34次独立的野生型MEF细胞迁移实验数据,采用配对t检验方法(SPSS13.0软件)进行统计学分析。统计分析结果提示,pH 6.8和PDGF对MEF细胞迁移的诱导不是加性的(t=7.72,d.f.=33,p=0.000),它们之间存在协同作用。当pH 6.8与PDGF同时刺激MEF细胞后,MEF细胞的迁移数是pH 6.8和PDGF分别刺激MEF细胞迁移数之和的1.5倍。胞内钙离子浓度测定实验结果揭示,胞外酸性促进MEF细胞内钙离子浓度的瞬时升高,且这一过程受到Gq蛋白调控。通过分别使用OGR1-, GPR4-,和TDAG8-KO的MEF细胞,结合Real-time PCR、Western blotting实验证实,已知的质子感知GPCRs(包括OGR1、GPR4、TDAG8和G2A)和质子感知的离子通道TRPV1不可能参与胞外酸性诱导的MEF细胞的迁移及胞内钙离子浓度的升高。本项研究得出结论：胞外酸性通过质子感知受体／Gi/p38MAPK信号通路,单独或协同PDGF促进MEF迁移,而质子感知受体/Gq／钙信号通路不参与此过程；已知的质子感知GPCRs(OGR1、GPR4、TDAG8和G2A)和质子感知离子通道TRPV1均不参与酸性诱导的细胞迁移及[Ca2+],的升高。本项研究结果证实,除了已知的四种质子感知受体外,还存在其他新的质子感知GPCR。
【关键词】：胞外酸性 质子感知的G蛋白偶联受体(GPCRs) 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) 细胞迁移 胞内钙离子浓度
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-14
• 英文缩写索引14-17
• 第一章 实验研究17-68
• 1.1 引言17-20
• 1.2 实验材料20-23
• 1.2.1 主要试剂与材料20
• 1.2.2 主要仪器与设备20
• 1.2.3 常用液体的配制20-23
• 1.3 实验方法23-37
• 1.3.1 小鼠胚胎的制备23
• 1.3.2 MEF细胞的制备23
• 1.3.3 MEF细胞的培养、传代23-24
• 1.3.4 MEF细胞的冻存、复苏24
• 1.3.5 细胞存活力的测定(MTT法)24-25
• 1.3.6 细胞增殖的测定(BrdU法)25-26
• 1.3.7 细胞划痕实验26-27
• 1.3.8 细胞迁移实验(Boyden chamber法)27
• 1.3.9 细胞蛋白质的提取27-28
• 1.3.10 Western blotting28-30
• 1.3.11 MEF细胞内钙离子浓度测定(Fura-2/AM,钙离子荧光探针法)30
• 1.3.12 实时荧光定量PCR30-32
• 1.3.13 小鼠尾中提取DNA32-33
• 1.3.14 DNA溶度的检测及完整性分析33
• 1.3.15 基因敲除小鼠DNA的基因分型检测(PCR法)33-36
• 1.3.16 实验数据的统计分析36-37
• 1.4 实验结果37-60
• 1.4.1 胞外酸性对MEF细胞迁移的影响37-48
• 1.4.1.1 胞外酸性单独或协同PDGF促进MEF细胞迁移37-42
• 1.4.1.2 胞外酸性对MEF细胞存活率和增殖的影响42-44
• 1.4.1.3 胞外酸性通过Gi蛋白偶联受体协同PDGF促进MEF细胞迁移44-46
• 1.4.1.4 胞外酸性协同PDGF促进MEF细胞迁移通过激活p38MAPK信号通路起作用46-48
• 1.4.2 胞外酸性对MEF胞内钙离子浓度的影响48-51
• 1.4.2.1 胞外酸性促进MEF细胞内钙离子浓度的升高48-49
• 1.4.2.2 胞外酸性通过Gq蛋白偶联受体诱导MEF胞内Ca~(2+)浓度升高49-50
• 1.4.2.3 Gq/11和TRPV1通道均未参与PDGF诱导的MEF胞内Ca~(2+)浓度升高50-51
• 1.4.3 MEF细胞应答胞外酸性的质子感知机制51-58
• 1.4.3.1 质子感知受体在MEF中的表达51-53
• 1.4.3.2 GPR4、TDAG8、OGR1未参与胞外酸性协同PDGF促进的细胞迁移53-55
• 1.4.3.3 TRPV1不参与胞外酸性协同PDGF促进的细胞迁移55-56
• 1.4.3.4 OGR1未参与胞外酸性诱导的MEF细胞胞内Ca~(2+)浓度升高56-57
• 1.4.3.5 TRPV1通道均未参与胞外酸性诱导的MEF细胞胞内Ca~(2+)浓度升高57-58
• 1.4.4 实验结果总结58-60
• 1.5 讨论60-65
• 1.5.1 胞外酸性通过质子感知受体/Gi/p38MAPK信号通路,单独或协同PDGF促进MEF迁移,而质子感知受体/Gq/钙信号通路不参与此过程60
• 1.5.2 胞外酸性与PDGF诱导的信号通路通过cross-talk相互作用60-62
• 1.5.3 胞外酸性可能通过Gq/PLC/IP3信号通路促进[Ca~(2+)_i的升高62-63
• 1.5.4 其他新的质子感知GPCR存在于MEF细胞中63-65
• 1.6 结论65
• 1.7 展望65-68
• 第二章 文献综述68-80
• 综述(一) 胞外酸性与肿瘤的浸润转移68-74
• 综述(二) 细胞迁移的信号传导机制进展74-80
• 参考文献80-88
• 致谢88-89
• 发表文章目录及科研项目89-90

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本文编号：383879