MIM蛋白调控单核巨噬细胞内吞氧化铁纳米材料及机制研究

发布时间：2023-08-04 18:55

　　氧化铁纳米颗粒(Iron oxide nanoparticles,IONPs)因其独特的理化性质和良好的生物相容性,在细胞分选、MRI造影、磁热疗、药物递送载体、诊断等生物医学领域得到了广泛的应用。当氧化铁纳米材料在体内应用时,往往经免疫调理作用被单核巨噬细胞识别并快速清除,或逐渐富集在肝、脾等器官。因此,单核巨噬细胞对氧化铁纳米材料的快速清除作用是其体内应用的主要障碍之一,相关研究也受到了广泛关注。MIM(missing in metastasis)蛋白又称为MTSS1,是一种在单核、巨噬细胞中高表达的膜相关蛋白,隶属于BAR蛋白质家族,可同时调控细胞膜的形变和细胞骨架的重构。巨噬细胞对纳米颗粒的内吞需要膜形变和细胞骨架的重构两个过程同时进行。因此,研究MIM与巨噬细胞内吞IONPs的作用机制,对氧化铁纳米颗粒进入体内的归宿、延长循环时间及靶向应用具有非常重要的意义。本论文的具体工作包括以下几个方面:(1)系统探讨氧化铁纳米颗粒进入巨噬细胞后的生物学效应。首先对IONPs进行生物安全性评价,通过MTT、Annexin V-FITC/PI凋亡、ROS等方法检测其细胞毒性。显微观察ION...

【文章页数】：123 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
本论文主要专用术语注释表
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 单核吞噬细胞系统简介
        1.2.1 单核巨噬细胞的来源
        1.2.2 单核巨噬细胞的生物学功能
        1.2.3 巨噬细胞的分类
    1.3 纳米材料与单核巨噬细胞的作用
        1.3.1 生物医用纳米材料
        1.3.2 氧化铁纳米材料
        1.3.3 单核巨噬细胞对纳米材料的内吞
    1.4 MIM蛋白研究进展
        1.4.1 BAR蛋白质超家族的简介
        1.4.2 BAR家族蛋白和内吞
        1.4.3 MIM蛋白的研究进展
    1.5 本论文的主要研究工作和创新点
第二章 摄入氧化铁纳米材料对单核巨噬细胞的影响
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 主要实验材料及仪器
        2.2.2 氧化铁纳米颗粒的制备与表征
        2.2.3 细胞的复苏、培养及冻存
        2.2.4 巨噬细胞摄取氧化铁纳米颗粒的测定
        2.2.5 细胞毒性测定
        2.2.6 单核细胞分化检测
        2.2.7 巨噬细胞RNA的提取
        2.2.8 荧光定量PCR检测
        2.2.9 数据分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 氧化铁纳米颗粒的表征
        2.3.2 巨噬细胞对纳米材料的摄入
        2.3.3 氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞的安全性评价
        2.3.4 氧化铁纳米颗粒对单核细胞分化的影响
        2.3.5 摄入氧化铁纳米颗粒对巨噬细胞铁代谢的影响
    2.4 本章小结
第三章 MIM蛋白通过与PI(4,5)P2 的作用参与细胞内吞
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 主要实验材料及仪器
        3.2.2 MIM及 I-BAR过表达细胞系的构建
        3.2.3 细胞内ATP和 ATP酶活性检测
        3.2.4 膜电位的检测
        3.2.5 细胞内钙离子检测
        3.2.6 IP3 的检测
        3.2.7 蛋白免疫印迹实验
        3.2.8 免疫共沉淀法检测蛋白之间的相互作用
        3.2.9 数据分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 细胞系的构建
        3.3.2 MIM通过二聚化影响细胞膜电位
        3.3.3 MIM对细胞内钙离子浓度的影响
        3.3.4 MIM介导内质网的钙离子释放
    3.4 本章小结
第四章 MIM通过网格蛋白促进巨噬细胞RAW264.7 对氧化铁纳米颗粒的内吞
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 主要实验材料及仪器
        4.2.2 RAW264.7细胞的培养
        4.2.3 质粒的转化
        4.2.4 质粒抽提
        4.2.5 细胞转染
        4.2.6 蛋白免疫印迹实验
        4.2.7 钙黄绿素荧光淬灭法检测氧化铁纳米颗粒
        4.2.8 普鲁士蓝染色
        4.2.9 SSC法测RAW264.7 对氧化铁纳米颗粒摄取
        4.2.10 邻二氮菲法测RAW264.7 对氧化铁纳米颗粒摄取
        4.2.11 流式细胞仪检测RAW264.7 内吞氧化铁纳米颗粒的途径
        4.2.12 荧光共聚焦检测蛋白之间的共定位
        4.2.13 免疫共沉淀法检测MIM与网格蛋白之间的相互作用
        4.2.14 分子动力学模拟MIM和网格蛋白clathrin之间的结合
        4.2.15 数据分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 沉默MIM对 RAW264.7 细胞吞噬纳米颗粒的影响
        4.3.2 过表达MIM对 RAW264.7 细胞内吞纳米颗粒的影响
        4.3.3 RAW264.7 摄取氧化铁纳米颗粒的内吞途径
        4.3.4 MIM与 clathrin荧光共定位的研究
        4.3.5 MIM和 clathrin的免疫共沉淀分析
        4.3.6 MIM的结构域与clathrin的共定位研究
    4.4 本章小结
第五章 MIM参与氧化铁纳米颗粒胞内转运的研究
    5.1 引言
    5.2 实验部分
        5.2.1 主要实验材料及仪器
        5.2.2 材料表征
        5.2.3 透射电镜观察纳米颗粒细胞内的定位
        5.2.4 细胞培养
        5.2.5 免疫荧光标记检测MIM的细胞内分布
        5.2.6 免疫共沉淀法检测MIM与 Rab蛋白之间的相互作用
        5.2.7 免疫荧光检测蛋白之间的共定位
        5.2.8 数据分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 纳米材料对MIM细胞内分布的影响
        5.3.2 MIM蛋白和Rab5、Rab7 相互作用的分析
        5.3.3 MIM和溶酶体共定位的分析
    5.4 本章小结
第六章 总结和展望
    6.1 论文总结
    6.2 工作展望
参考文献
攻读博士期间的学术成果
致谢



本文编号：3838819