用代谢组学方法研究DNA甲基化对花生四烯酸代谢的影响及血管内皮激活的机制

发布时间：2017-05-23 12:22

  本文关键词：用代谢组学方法研究DNA甲基化对花生四烯酸代谢的影响及血管内皮激活的机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血管内皮作为多种血管疾病或危险因子作用的靶器官,在血管疾病的病情进展中发挥着无可比拟的作用。因血管内皮细胞具有活跃的内分泌及代谢功能,所以在维持血液的正常流动、调控管壁的张力、参与管壁的炎症与修复等过程中发挥重要的作用。紊乱的内皮功能是多种心血管疾病的共同病理基础,而且血管内皮功能障碍是导致全身脉管系统动脉粥样硬化的血管损伤的早期阶段表现。因此,血管内皮的功能研究对于脉管系统疾病的预防及治疗具有重要意义。本实验室前期研究发现花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的CYP450通路代谢酶—可溶性表氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase)通过调控表氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)和二羟-二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)在内皮细胞中含量而影响内皮细胞功能。同时,编码可溶性表氧化物水解酶的基因EXPH2受DNA去甲基化调控,影响sEH的表达水平及EETs/DHETs的比例,进而诱导内皮功能失调。因此,探究AA的代谢平衡对内皮细胞功能具有深远的意义。近年来,在探讨心血管疾病的病因诊断及防治过程中,表观遗传学扮演着至关重要的作用,但表观遗传尤其是DNA甲基化对AA代谢的影响目前鲜有报道。本课题研究目的是探索DNA甲基化对AA代谢通路间平衡的影响,并进一步阐释在低甲基化状态下相关代谢产物发挥的重要作用,以期进一步为相关疾病的研究和治疗提供新的思路。首先我们使用超高效液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)检测经甲基化转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine(5-AZA)处理过的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内的AA代谢产物的变化。通过检测细胞内AA的COX,LOX及CYP450三大代谢通路中的酶促代谢产物。该代谢组学方法可以定量检测30余种AA的代谢产物。我们发现:AA代谢途径中COX通路代谢酶对甲基化调控更敏感;处理组细胞内容物AA代谢谱明显改变,表现为COX通路代谢产物含量增加,尤其是前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)和血栓烷素(thromboxane B2,TXB2)显著增加。通过Methyl primer express软件进行生物信息学分析,我们发现与其它两条代谢通路相比,COX通路的代谢酶普遍含有更丰富的CpG岛,受DNA甲基化调控的潜力更大。基于此生物信息学分析结果,通过q PCR验证发现多个COX通路中的代谢酶的基因表达显著升高。在HepG2和HEK293T细胞中验证的结果与信息学分析预测吻合,我们推测DNA甲基化调控AA代谢酶的表达存在普遍性。进一步,DNA甲基化特异性分析实验证实前列腺素D合酶(PTGDS)和血栓素合酶1(TBXAS1)的基因启动子区甲基化状态发生改变。细胞功能研究发现,5-AZA可以明显增加血管粘附因子(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)及细胞附分子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因表达水平,诱导内皮细胞的激活。COX通路抑制剂预处理可以显著降低COX通路代谢产物,同时抑制VCAM-1和ICAM-1的表达,提示内皮细胞的激活被抑制。以代谢组学手段分析5-AZA处理的小鼠,结果发现处理组的血浆,肝脏和肾脏的代谢谱结果类似,即:COX通路代谢产物显著升高,与体外实验的AA代谢谱改变一致。同时,经q PCR检测我们发现主动脉及肝脏中PTGDS和TBXAS1基因表达水平也被上调。综上所述,我们得出以下结论:1)DNA甲基化可以调控AA代谢通路中某些关键酶的基因表达水平;2)DNA甲基化在AA代谢平衡中具有重要作用,而且COX通路对于DNA甲基化的调控更敏感;3)PTGDS和TBXAS1因DNA甲基化处理更加敏感,从而在AA代谢平衡的紊乱中发挥重要影响;4)代谢产物前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)和血栓烷素(thromboxane B2,TXB2)参与5-AZA诱导的内皮细胞活化。总之,DNA甲基化通过调控AA代谢途径关键酶的表达水平,增加相应代谢产物的浓度,进而造成AA代谢平衡的紊乱,内皮细胞的功能失调。
【关键词】：DNA甲基化 AA 代谢组学 内皮细胞 前列腺素
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-13
• 前言13-19
• 研究现状、成果13-18
• 研究目的、方法18-19
• 一、DNA甲基化引起内皮细胞AA代谢失衡19-43
• 1.1 对象和方法19-34
• 1.1.1 主要试剂19-20
• 1.1.2 主要仪器20-22
• 1.1.3 主要试剂的配制22-25
• 1.1.4 细胞的培养及处理25-30
• 1.1.5 细胞内容物的代谢产物检测30-31
• 1.1.6 细胞内基因实时定量PCR分析31-34
• 1.1.7 DNA甲基化特异型分析实验34
• 1.1.8 统计分析34
• 1.2 结果34-41
• 1.2.1 5-AZA诱导的DNA去甲基化影响AA代谢通路间平衡34-38
• 1.2.2 5-AZA调控AA代谢酶的基因表达水平38-39
• 1.2.3 5-AZA影响AA代谢酶的表达不是内皮细胞特异性的39-41
• 1.3 讨论41-42
• 1.3.1 代谢组学研究AA代谢的意义41
• 1.3.2 DNA甲基化对AA代谢酶的作用41-42
• 1.3.3 AA代谢产物对血管的影响42
• 1.4 小结42-43
• 二、DNA甲基化特异性分析验证甲基化状态改变43-54
• 2.1 对象和方法43-50
• 2.1.1 主要仪器43
• 2.1.2 主要试剂43-44
• 2.1.3 主要试剂配制44-46
• 2.1.4 细胞的培养与处理46-47
• 2.1.5 DNA的甲基化特异性PCR分析47-49
• 2.1.6 相关的分子生物学实验49-50
• 2.1.7 统计分析50
• 2.2 结果50-53
• 2.2.1 生物学分析TBXAS1的启动子区CpG岛的含量50-51
• 2.2.2 BSP验证TBXAS1的启动子区甲基化状态改变51-52
• 2.2.3 生物学分析PTGDS的启动子区CpG岛的含量52-53
• 2.2.4 BSP验证PTGDS的启动子区甲基化状态改变53
• 2.3 讨论53
• 2.4 小结53-54
• 三、DNA去甲基化诱导AA代谢紊乱的病理意义54-65
• 3.1 对象和方法54-60
• 3.1.1 主要仪器54
• 3.1.2 主要试剂54-55
• 3.1.3 主要试剂配制55-58
• 3.1.4 内皮细胞的培养与处理58
• 3.1.5 细胞内代谢产物的萃取58
• 3.1.6 实时定量PCR分析58
• 3.1.7 蛋白电泳与蛋白质印记58-60
• 3.1.8 统计分析60
• 3.2 结果60-63
• 3.2.1 DNA去甲基化诱导内皮细胞的激活60-62
• 3.2.2 高同型半胱氨酸 (HCY) 模型中AA代谢谱的改变62-63
• 3.3 讨论63-64
• 3.4 小结64-65
• 四、在体验证DNA甲基化对AA代谢影响65-72
• 4.1 对象和方法65-69
• 4.1.1 主要仪器65
• 4.1.2 主要试剂65
• 4.1.3 主要试剂配制65
• 4.1.4 动物的饲养与处理65-66
• 4.1.5 血浆及组织内代谢产物的萃取66-67
• 4.1.6 实时定量PCR分析67-69
• 4.1.7 统计分析69
• 4.2 结果69-71
• 4.2.1 血浆及肝脏内AA代谢产物的检测69-70
• 4.2.2 在体检测组织内靶基因的表达水平70-71
• 4.3 讨论71
• 4.4 小结71-72
• 全文讨论72-75
• 全文结论75-76
• 论文创新点76-77
• 参考文献77-89
• 发表论文和参加科研情况说明89-91
• 综述91-106
• 综述参考文献98-106
• 致谢106-107

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 席锐;邹琛;陈桢s

本文编号：387960