靶向TGF-βⅡ型受体的适配子壳聚糖缓释凝胶对大鼠滤过术后结膜瘢痕的作用研究

发布时间：2017-05-24 00:15

  本文关键词：靶向TGF-βⅡ型受体的适配子壳聚糖缓释凝胶对大鼠滤过术后结膜瘢痕的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:目前抗青光眼手术是青光眼降眼压治疗的主要治疗方式,而滤过通道结膜瘢痕是手术失败的主要原因,因此通过抑制结膜瘢痕化以提高抗青光眼手术的成功率仍是眼科研究的重要方向之一。目前临床上广泛应用丝裂霉素C(MMC)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)降低青光眼术后瘢痕化,提高滤过术成功率,但仍然存在某些并发症,包括愈合延迟、术后浅前房、滤过泡渗漏及角膜毒性等,严重影响手术效果1,2。临床上尚缺乏有效的、毒副作用小的药物以减少瘢痕形成,延长滤过泡生存时间。研究报道转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在结膜瘢痕形成过程中起重要作用,并且在青光眼房水中发现其含量增加3-5。抗纤维化治疗的一个重要方向就是靶向配体或者受体作用,特异性阻断TGF-β作用,可减弱结膜组织的纤维化4,6,7。TGF-β信号转导途径主要通过与细胞膜上的受体(transforming growth factor-βreceptor,TβR)结合发挥生物学作用,TGF-β首先与TβR II结合再与TβR I形成TGF-β-TβR II-TβR I复合体,TβR II磷酸化TβR I的GS区,启动细胞内信号转导8-11。TGF-β与TβR II的结合是信号转导开始的始动因素,通过靶向TβR II以抑制配体与受体相结合达到减弱其生物学效应的作用。本课题组前期应用SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)筛选得到靶向TβR II胞外段的特异核酸适配子,是一类功能与抗体类似的新型分子,具有亲和力高、组织穿透能力强等特点12。在人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)上进一步筛选和验证了适配子S58可通过靶向结合TβR II从而抑制TGF-β的作用,结果显示适配子S58可抑制TGF-β2诱导的HTFs向肌成纤维细胞转分化13。为了延长核酸适配子的作用时间,更好地应用于体内实验,我们使用壳聚糖(chitosan,CS)纳米微粒包裹适配子S58(CS/S58),延长其作用时间14。壳聚糖温敏型水凝胶作为一种新型的可用于可注射、非静脉的给药方式,具有优异的控释、缓释、靶向性,可将药物直接送达病原部位,选择性地释放药物,既可以保护药物不被酶解,又使药物在靶区达到所需的药物浓度,提高疗效减少药物的毒副作用;此外,壳聚糖无毒,且有良好的生物相容性和降解性15-19。研究表明壳聚糖可抑制瘢痕成纤维细胞的增殖20,21,因此本研究制备了壳聚糖温敏型水凝胶包被适配子S58,观察其对结膜瘢痕化过程的作用。目的:本研究拟在细胞实验进一步筛选具有阻抑作用的适配子,并将筛选的适配子S58应用壳聚糖凝胶包被,以增加适配子作用时间,减少酶类的降解,进一步探讨壳聚糖/适配子S58温敏缓释凝胶(CS/S58)在大鼠滤过术模型中的抗瘢痕形成的作用。方法:1.通过原代培养人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblast,HTF),观察TGF-β2诱导HTF转分化的作用,检测核酸适配子对TGF-β2作用的干扰效应,Western blot及细胞免疫荧光技术检测α-SMA、p Smad2的表达情况,进一步筛选具有阻抑作用的核酸适配子;2.制备壳聚糖温敏型凝胶,应用该凝胶包被核酸适配子,在体外检测凝胶的包被率及适配子的缓释效应;3.构建大鼠青光眼滤过术(glaucoma filtration surgery,GFS)模型,分别用TGF-β2、MMC、壳聚糖凝胶(CS)和CS/S58凝胶处理球结膜瓣,应用裂隙灯及AS-OCT观察滤过泡的形态及存活时间,监测眼压变化,狼红染色观察手术区胶原纤维的沉积;Western blot及组织免疫化学染色检测手术区结膜组织表达Collagen I、α-SMA情况,检测组织的炎症反应及细胞增殖与凋亡情况。结果:1.TGF-β2诱导HTF表达α-SMA,并且2 ng/ml、5 ng/ml浓度组作用达高峰,2ng/ml与5 ng/ml TGF-β2组α-SMA表达差异无明显统计学意义(P0.05);TGF-可促进HTF骨架蛋白F-actin及p Smad2的表达,并显著增强HTF的收缩力。2.适配子S58(20 n M)可阻抑TGF-β2(2 ng/ml)诱导HTF表达α-SMA、F-actin的作用,减弱Smad2磷酸化水平以及p Smad2向细胞核内转位;并抑制TGF-β2介导HTF细胞收缩;适配子S68对TGF-β2诱导HTF的作用无明显影响。3.建立壳聚糖/β-甘油磷酸钠(CS/β-GP)温敏型凝胶系统,CS/β-GP溶液于37℃水浴2~3 min可由液体转变为水凝胶,摩尔比为1:2.6包被适配子S58,包被率达到88.4±7.2%,体外可持续缓释,1mo的持续缓释率为84±6.0%。4.采用微管植入法构建大鼠GFS模型,滤过泡生存比率=术后28 d/术后3 d滤过泡面积×100%,每组至少有8只大鼠,Control组滤过泡生存比率为17±7%,TGF-β组为15±5%,MMC组为30±7%,CS组为28±8%,CS/S58组为36±9%;TGF-β、MMC、CS及CS/S58组与对照组相比的平均眼压比例分别为95±14%、103±12%、84±21%、78±18%、72±20%。5.GFS术后1 w TGF-β2(2 ng/ml)组手术区球结膜可见大量炎性细胞浸润,细胞大量增殖,结膜组织下致密的胶原纤维沉积,Col I、α-SMA表达明显增加;MMC(0.4 mg/ml)处理的球结膜区细胞数量稀少,组织疏松,细胞凋亡较多,结膜上皮下仍可见较多胶原纤维沉积。6.CS凝胶组GFS术后1 w结膜下仍可见未吸收的壳聚糖,壳聚糖周围可见大量炎性细胞浸润,以及部分凋亡的细胞,与对照组相比较,CS凝胶未加重结膜组织的胶原沉积,Col I表达反而降低;与CS组比较,CS/S58凝胶组炎性细胞浸润较少,胶原纤维沉积减少,Col I、α-SMA表达均明显减少。结论:1.在体外细胞实验,靶向TβRII的核酸适配子S58可阻抑TGF-β2诱导HTF向MF转分化,并阻抑p Smad2的表达以及其胞核内转位,提示适配子S58可干扰TGF-β与其受体相结合,减弱TGF-β的生物学作用;2.TGF-β2可加重滤过泡的炎症反应,引起细胞大量增殖,导致手术区结膜组织下致密胶原纤维沉积,滤过泡生存时间明显缩短,进一步明确TGF-β2促进结膜瘢痕形成的机制;MMC可能通过抑制组织细胞增殖并诱导凋亡而延长滤过泡的生存时间;3.壳聚糖温敏凝胶可有效的包被适配子S58,体外持续缓释长达1 mo,累积缓释率达84%;CS/S58凝胶可抑制大鼠滤过术后结膜组织炎性反应,显著抑制Col I、α-SMA表达以及胶原纤维沉积,滤过泡生存时间显著延长,提示CS凝胶联合适配子S58对结膜瘢痕的抑制效应明显强于单独CS凝胶的作用,有望为青光眼术后抗瘢痕治疗提供新的思路和方法。
【关键词】：适配子 转化生长因子-β(TGF-β) 青光眼滤过术(GFS) 壳聚糖 水凝胶
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R779.6
【目录】：

• 英文缩写词一览表5-8
• 英文摘要8-13
• 中文摘要13-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 靶向TGF-β II型受体的核酸适配子S58阻抑TGF-β2 诱导Tenon’s囊成纤维细胞转分化19-36
• 2.1 材料及设备19-22
• 2.2 实验内容及方法22-26
• 2.3 结果26-33
• 2.4 讨论33-36
• 第三章 壳聚糖/核酸适配子S58温敏型缓释凝胶制备及检测36-45
• 3.1 材料及设备36-37
• 3.2 实验内容及方法37-39
• 3.3 结果39-42
• 3.4 讨论42-45
• 第四章 大鼠滤过术模型的构建与壳聚糖/S58缓释凝胶对滤过泡瘢痕形成的抑制作用45-73
• 4.1 大鼠滤过术后结膜滤泡形态及存活的状态监测实验内容及方法45-54
• 4.1.1 材料与设备45-48
• 4.1.2 结果48-51
• 4.1.3 讨论51-54
• 4.2 壳聚糖/核酸适配子S58温敏型缓释凝胶抑制大鼠滤过术后结膜胶原沉积 .54-73
• 4.2.1 实验内容及方法54-60
• 4.2.2 结果60-69
• 4.2.3 讨论69-73
• 全文结论73-74
• 本研究的创新之处74-75
• 参考文献75-92
• 文献综述 青光眼滤过术后抗结膜瘢痕形成的研究进展92-116
• 参考文献101-116
• 攻读博士学位期间发表论文116-117
• 致谢117

【参考文献】

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1 李骏,庞琳;抗青光眼滤过术中应用5-氟尿嘧啶和丝裂霉素C对泪膜的影响[J];中华眼科杂志;2001年01期

  本文关键词：靶向TGF-βⅡ型受体的适配子壳聚糖缓释凝胶对大鼠滤过术后结膜瘢痕的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：389438