转录因子Zeb1在大脑皮层发育中的作用及机制研究

发布时间：2024-02-29 00:34

　　背景:大脑皮层是大脑的重要组成部分,参与躯体运动调节、情感和意识的形成等。大脑皮层发育的异常会导致一系列发育性疾病的产生,比如小头症、无脑回综合症等。神经干细胞是大脑中所有细胞的来源,它的正常增殖、分化及分化后的正常迁移是保证大脑皮层正常发育的关键因素,而转录因子在调节神经干细胞的一系列细胞生物学行为中起到关键的作用。本文的主要研究对象是转录因子Zeb1,是典型的螺旋-环-螺旋型转录因子,该类型的转录因子在神经系统的发育及损伤修复中起到重要的作用。目的:目前对大脑皮层发育分子调节机制的了解还十分有限,本实验旨在探索Zeb1在大脑皮层发育过程中所起到的作用及机制。方法:(1)通过蛋白免疫印迹和免疫荧光在体内和体外检测Zeb1在大脑皮层发育过程中表达的时间和细胞定位。(2)利用Zeb1敲除小鼠检测Zeb1敲除后对大脑皮层分层发育的影响,对放射状胶质细胞增殖、分化、分裂轴角度的影响,对体外分离的神经放射状胶质细胞分裂模式的影响。(3)用胚胎子宫电转(IUE)的方法检测干扰Zeb1后对皮层神经元迁移的影响。(4)用基因芯片筛查加荧光定量PCR验证的方法筛查Zeb1的下游调控基因。通过荧光报告素...

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 神经系统及大脑皮层发育的开端
    1.2 神经干细胞的增殖分化与迁移
    1.3 大脑皮层发育过程中转录因子的协作
    1.4 信号通路在大脑皮层发育过程中的作用
        1.4.1 Sonic hedgehog通路
        1.4.2 Wnt信号通路
        1.4.3 Notch信号通路
    1.5 上皮与间质转化以及关键转录因子Zeb1
    1.6 PRMT5
    1.7 Pak3(p21-activated kinases)
第二章 转录因子Zeb1 对小鼠大脑皮层的发育的影响
    2.1 引言
    2.2 实验动物和仪器
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 仪器设备
    2.3 实验材料与方法
        2.3.1 免疫印迹与免疫荧光
        2.3.2 冰冻切片样品的准备
        2.3.3 免疫荧光
        2.3.4 神经干细胞的体外培养
    2.4 实验结果
        2.4.1 Zeb1 在胚胎不同发育阶段的大脑皮层中的表达谱
        2.4.2 Zeb1 在胚胎发育阶段的大脑皮层中的定位
    2.5 小结与讨论
第三章 敲除Zeb1 基因对大脑皮层发育的影响
    3.1 引言
    3.2 实验动物和仪器
        3.2.1 实验动物
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验材料与方法
        3.3.1 大脑皮层分层免疫荧光染色
    3.4 实验结果
    3.5 小结与讨论
第四章 敲除Zeb1 抑制神经干细胞增殖并促进其分化
    4.1 引言
    4.2 实验动物和仪器
        4.2.1 实验动物
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验材料与方法
        4.3.1 免疫荧光
        4.3.2 实验方法
        4.3.3 细胞周期退出检测
        4.3.4 单细胞分裂检测
    4.4 实验结果
        4.4.1 敲除Zeb1 导致干细胞增殖能力下降
        4.4.2 敲除Zeb1 抑制放射状胶质细胞的增殖,促进其分化
        4.4.3 Zeb1 敲除促使神经干细胞退出细胞周期
        4.4.4 敲除Zeb1 促进神经干细胞在体内的不对称分裂
    4.5 小结与讨论
第五章 敲除Zeb1 促进了过早成熟的神经元的迁移
    5.1 前言
    5.2 实验动物和仪器
        5.2.1 实验动物
        5.2.2 仪器设备
    5.3 实验材料与方法
        5.3.1 干扰质粒的构建
        5.3.2 细胞的培养与干扰质粒的转染
        5.3.3 荧光定量PCR验证
        5.3.4 胚胎子宫电转(IUE)
    5.4 实验结果
        5.4.1 干扰Zeb1 促进表层神经元迁移
    5.5 小结与讨论
第六章 Zeb1 调控皮层神经元迁移机制的研究
    6.1 前言
    6.2 实验动物和仪器
        6.2.1 实验动物的和细胞
        6.2.2 实验仪器
    6.3 实验材料与方法
        6.3.1 取材及基因型鉴定
        6.3.2 干细胞的培养
        6.3.3 干细胞RNA的提取
        6.3.4 组织RNA的提取
        6.3.5 基因芯片
        6.3.6 反转录与荧光定量PCR
        6.3.7 Zeb1 基因的克隆
        6.3.8 启动子区的克隆
        6.3.9 双荧光报告素酶基因检测
        6.3.10 染色质免疫共沉淀(ChIP)
        6.3.11 免疫共沉淀
        6.3.12 考马斯亮蓝染色及质谱鉴定
        6.3.13 细胞的免疫荧光
        6.3.14 胚胎子宫电转(IUE)
    6.4 实验结果
        6.4.1 芯片结果及qPCR结果验证
        6.4.2 荧光报告素酶基因验证
        6.4.3 过表达Pak3 促进神经元的迁移
        6.4.4 Zeb1与PRMT5 共同调控Pak3 基因的转录
        6.4.5 Zeb1与PRMT5 共定位
        6.4.6 PRMT5 辅助Zeb1 抑制Pak3 的转录
    6.5 小结与讨论
第七章 Zeb1 募集PRMT5 调控神经元迁移的功能研究
    7.1 前言
    7.2 实验动物和仪器
        7.2.1 实验动物
        7.2.2 实验仪器
    7.3 实验方法
        7.3.1 胚胎子宫电转(IUE)
        7.3.2 Pak3 干扰质粒的构建
        7.3.3 干扰质粒的验证
        7.3.4 N2A细胞的转染及RNA的提取
        7.3.5 荧光定量PCR
        7.3.6 Pak3 抗干扰同义突变质粒的构建
    7.4 实验结果
    7.5 小结与讨论
全文总结与讨论
展望
参考文献
致谢
攻读博士学位期间以单独第一作者发表或录用的论文



本文编号：3914214