动脉粥样硬化中血管细胞粘附分子-1的表达与基因干预研究

发布时间：2017-05-25 13:19

  本文关键词：动脉粥样硬化中血管细胞粘附分子-1的表达与基因干预研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景目的随着经济的发展和人民生活水平的提高,动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)相关性疾病已成为威胁人类健康的主要杀手,AS是一种系统性疾病,病变常同时累及全身大中动脉血管,主要表现为动脉管壁脂质及纤维基质堆积,管腔狭窄。AS也是冠状动脉性心脏病(coronary heart disease, CHD)的主要病理类型。AS的病因及确切发病机制目前尚不清楚,现有的研究证实炎症反应在AS的发展过程中起重要作用。根据“损伤-反应”和慢性炎症学说,各种AS危险因素可以导致动脉内皮细胞(endothelial cell, EC)损伤,随后EC表达细胞粘附分子(cell adhesion molecules)增加,如血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1).细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM)、血小板-内皮细胞粘附分子-1(platelet-endothelid cell adhesion molecule-1, PEC AM-1)等,趋化血液单核细胞及T淋巴细胞粘附。单核细胞及T淋巴细胞进入内膜下启动炎性反应,分泌一系列细胞因子,如白细胞介素(interleukin, IL)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein, MCP)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等,这些细胞因子可进一步激活EC、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)及巨噬细胞,促进粥样斑块的发生、发展。VCAM-1属于免疫球蛋白超家族,其分子量为100-1 10KD,配体是分布于白细胞表面的VLA-4分子。VCAM-1在血管内皮细胞上表达,可以促进白细胞和血管内皮细胞的粘附,加速白细胞向血管内皮下游走,并能促进SMC的增殖,因此认为VCAM-1在AS中发挥重要作用,加速了AS的发生发展过程。内皮细胞表面的VCAM-1可以脱落进入血液形成可溶性VCAM-1 (soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1)。因为直接测定血管内皮组织中的VCAM-1相对困难,目前国内外研究多通过测定血液中的sVCAM-1作为测定VCAM-1的间接指标。Hackmen等研究发现高TG患者血液中sVCAM-1水平上升。为了进一步明确VCAM-1与CAD的关系,本研究选择行主动脉-冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft, CABG)时废弃的主动脉管壁组织,应用免疫组化检测VCAM-1表达,探讨人体动脉组织VCAM-1表达与AS发病机制的关系。材料方法1.研究对象(1)对象：选取2008年12月至2012年2月在山东大学附属千佛山医院行CABG患者36例,其中男性27例,女性9例,年龄为48-78岁,平均63.6±9.2岁。36例CABG患者中合并吸烟者6例,高血压15例,糖尿病12例。对照组为12例肾脏移植手术供体者,均为男性,年龄为34-52岁,平均39.4±4.5岁。入院后经查体排除各种明显器质性疾病。(2)标本：研究组患者行CABG时留取废弃的全层主动脉组织,36例CABG取得动脉组织56块。对照组供体者行肾脏移植手术时留取废弃的肾动脉组织,12例肾脏移植取得动脉组织46块。2.生化分析所有研究组患者及对照组成员均于清晨空腹采静脉血6m1,于山东大学附属千佛山医院中心实验室测定静脉血浆总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides,TG)及脂蛋白(a) [lipoprotein (a), Lp(a)]、载脂蛋白A (apolipoprotein, ApoA)、脂蛋白B (apolipoprotein B, ApoB)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)、间接胆红素(indirect bilirubin, IBIL)等生化指标。3.冠状动脉造影及冠状动脉Gensini积分测定所有研究组患者均行冠状动脉造影(coronary angiography, CAG),对造影结果进行录像并刻录光盘,由两位介入心血管病专家分析图像。通过目测法判定冠状动脉狭窄程度。应用冠状动脉Gensini积分方法评价冠状动脉病变严重程度。4.标本采集及免疫组化研究组36例患者行CABG手术时留取其打孔废弃的主动脉壁全层组织,对照组为12例肾移植供体者移植时修剪废弃的动脉组织。上述组织获取后,立即储存于-80℃冰箱内备用。两组动脉管壁组织标本经10%福尔马林溶液固定、梯度酒精脱水、二甲苯脱酒精、石蜡包埋、切片。选择多聚赖氨酸进行载玻片防脱片处理,切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化,柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复,3%双氧水消除内源性过氧化物酶活性,加入兔抗人VCAM-1多克隆抗体(1：300),4℃冰箱孵育过夜,加入酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物,室温孵育30min, DAB显色,镜下控制显色时间,苏木素复染、分化、返蓝、梯度酒精脱水、二甲苯脱酒精、晾干、中性树脂封片。免疫组化染色切片经显微图像分析系统检测,每张切片随机选取3个高倍视野,测定每个视野中阳性信号的平均光密度值(optical density, OD),取其平均值即为VCAM-1相对表达量。5.统计学处理所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。测定数值以均数±标准差(x±s)表示,计量资料均数组间比较采用t检验,两变量之间相关性采用直线相关分析P0.05为差异有统计学意义。结果1.研究组及对照组一般情况比较研究组患者36例均行CABG,其中男性27例,女性9例,年龄为46-78岁,平均63.6±9.2岁。36例CABG患者中合并吸烟者6例,高血压15例,糖尿病12例。对照组为12例肾脏移植手术供体者,均为男性,年龄为34-52岁,平均39.4±4.5岁。入院后经查体排除各种明显器质性疾病。2.生化指标：研究组36例患者血浆TC. LDL-C及Lp(a). ApoB. TG测定值较正常参考值显著升高,P0.05；血浆HDL-C及ApoA测定值与正常参考值相比明显降低,P0.01；研究组患者血浆TBIL及IBIL测定值较正常参考值显著降低,P0.05；血浆DBIL测定值虽然较正常参考值降低,但差异未达到统计学意义,P0.05。2.CAG研究组36例患者行CAG结果显示冠状动脉均有不同程度的钙化、狭窄和迂曲,其中LM病变14例,三支病变14例,二支病变合并LAD近端病变8例；合并慢性闭塞病变4例。研究组36例患者冠状动脉Gensini积分为24-128,平均66.64±29.11。3.动脉组织中VCAM-1表达情况研究组36例患者主动脉组织免疫组化检测均有不同程度的VCAM-1表达,主动脉组织VCAM-1表达量为0.14-0.400D,平均0.21±0.050D。VCAM-1阳性表达着色主要分布于内皮细胞及平滑肌细胞的胞浆,表现为棕褐色,染色分布不均匀,呈颗粒状、片状、簇状或条状。对照组12例动脉组织常规病理组织学检查无异常,免疫组化检测动脉组织VCAM-1表达量为0.06-0.10OD,平均0.08±0.030D,研究组和对照组相比差异有统计学意义,P0.05。4.研究组主动脉组织VCAM-1表达量与AS主要危险因素的关系研究组36例患者主动脉组织VCAM-1表达量男性为0.21±0.040D,女性为0.20±0.070D,男女之间比较,差异无统计学意义(P0.05)；吸烟者为0.27±0.050D,非吸烟者为0.15±0.040D,差异有统计学意义(P0.05)；高血压患者为0.23±0.060D,非高血压患者为0.19±0.040D,差异有统计学意义(P0.05)；糖尿病患者为0.27±0.080D,非糖尿病患者为0.19±0.020D,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。5.研究组主动脉组织VCAM-1表达量与血脂水平相关性分析研究组36例患者主动脉组织VCAM-1表达量分别与TG、TC、LDL-C、 HDL-C、Lp(a)、ApoAI、ApoB行线性相关分析,结果提示VCAM-1表达量与TG、TC、LDL-C、Lp(a)、ApoB呈正相关,P0.05。VCAM-1表达量与HDL-C. ApoA、TBIL、DBIL、IBIL测定值负相关,P0.05。6.研究组主动脉组织VCAM-1表达量与冠状动脉Gensini积分相关性分析研究组36例患者主动脉组织VCAM-1表达量与冠状动脉Gensini积分相关性分析,结果提示VCAM-1表达量与冠状动脉Gensini积分呈正相关(r=0.431,P0.05)。结论1.本研究显示,研究组36例CAGB患者主动脉组织免疫组化检测VCAM-1表达量平均为0.21±0.050D,而对照组12例肾移植废弃的动脉组织免疫组化检测VCAM-1表达量平均为0.08±0.030D,研究组VCAM-1表达量较对照组明显增高,两组差异有统计学意义(P0.05)。2.研究组36例CABG患者冠状动脉造影显示,其Gensini积分平均为66.64±29.11,与主动脉组织免疫组化检测VCAM-1的表达量呈正相关。3. CABG患者主动脉组织中VCAM-1表达水平与血浆TG, TC、LDL-C、 LP(a)、ApoB呈正相关,与血浆HDL-C、ApoA呈负相关。4.本研究组患者有吸烟、高血压、糖尿病等病史,较没有吸烟、高血压、糖尿病等病史的患者,其主动脉组织中VCAM-1表达量显著增高。背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)相关性疾病日益成为人类健康的最主要威胁,在许多国家由于AS所导致的心血管疾病已成为首位死亡原因。AS是一种主要累及大动脉和中动脉的慢性进展性疾病,在动脉内皮下形成斑块,造成管腔的狭窄和动脉内血栓形成,最终导致严重的临床后果。目前的研究均发现AS的发生、发展过程中有大量的炎性细胞的参与并分泌多种炎性介质,炎症学说得到大多数学者公认。血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)在AS的病理生理过程中发挥着重要作用。在动脉硬化发生的早期,白细胞的粘附、聚集是一个非常重要的环节,正常的血管内皮不与白细胞粘附,但在动脉硬化部位白细胞粘附于内膜表面,并穿过内皮细胞间连接进入到内膜。内皮细胞表面表达的粘附分子参与了白细胞进入内膜的过程。VCAM-1在血管内皮细胞上表达,可以促进白细胞和血管内皮细胞的粘附,加速白细胞向血管内皮下游走,并能促进SMC的增殖,因此认为VCAM-1在AS中发挥重要作用,加速了AS的发生发展过程。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA(double stranded, dsRNA)介导的基因沉默现象。当一段与内源性mRNA编码区相同的dsRNA被导入细胞时,该mRNA就会发生降解,造成基因在转录或翻译的环节发生阻断而抑制基因的表达,引起基因沉默。RNAi目前作为一种替代基因敲除的研究工具得到广泛的应用。目前RNAi技术中常使用的dsRNA载体有两种,一种是非病毒载体,主要指携带dsRNA的质粒,其主要的缺点是转染率较低。另一种dsRNA载体为病毒载体,其中,慢病毒载体应用最为广泛,其优点是基因表达稳定、基因转移高效、免疫原性小、生物安全性高等。慢病毒载体介导的干扰导致的靶基因活性改变最为稳定,且最为持久。目的：本研究利用载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)构建AS模型,并通过慢病毒介导的RNAi技术使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默,观察VCAM-1在AS进展中所起的作用,为AS的治疗提供思路。材料方法：1.动物模型制备共30支雄性8周龄ApoE-/-小鼠,体重20g-25g,给予高脂饲料饲养。4周后,小鼠被随机分为对照组和基因干预组,每组15只。对照组小鼠经股静脉注射空载体慢病毒悬液(1x108 TU/ml,20ul),基因干预组小鼠经股静脉注射VCAM-1干扰慢病毒悬液(1x108TU/ml,20ul)。注射慢病毒4周后,腹腔注射10%水合氯醛0.1ml将小鼠麻醉,将小鼠四肢固定在鼠板上,用剪刀剪开胸前皮肤,并剪断胸骨,使心脏暴露。经右心房穿刺抽取静脉血1.5m1。用眼科剪将右心耳剪开一缺口,用输液器针头从心尖处插入约2mm,应用无菌生理盐水灌流冲洗心腔及主动脉血管,直到肝脏及肺脏颜色由鲜红色转变为淡黄色或白色,停止灌流。小心剥离心脏和全程主动脉,于髂动脉处将其完整剪下。由升主动脉处剪下心脏,剪去心脏心尖部分,于冰冻切片机内包埋于OCT中,包埋好的组织于冰冻切片机中连续切片,置于-20℃冰箱中保存。剩余主动脉组织置于-20℃冰箱中保存。2.血脂测定ApoE-/-小鼠麻醉后固定于鼠板上,剪开胸腔,经右心房采取静脉血1.5m1,离心分离血清,应用生化自动分析仪测定血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、血清甘油三酯(triglycerides, TG)水平。3. Western Blot利用Western Blot方法检测对照组及基因沉默组小鼠主动脉组织VCAM-1蛋白表达水平。4.组织学分析小鼠主动脉根部组织经OCT包埋机包埋后切片。组织切片分别进行HE染色、油红O染色及巨噬细胞MOMA-2染色。5.数据分析利用统计分析软件SPSS 13.0进行数据分析。数值变量用均数士标准差(x士s)来表示,计量资料之间的均数比较采用t检验,以P0.05为差异具有统计学意义。结果：1.小鼠体内转染慢病毒的安全性经股静脉向ApoE-/-小鼠体内注射慢病毒悬液或空载体慢病毒悬液后,观察小鼠进食、饮水状况,未发现异常现象,两组小鼠均未发生死亡。试验结束前称重,两组小鼠间体重并未见明显差异(P0.05)。2. ApoE-/-小鼠主动脉组织的VCAM-1蛋白表达水平Western Blot检测ApoE-A小鼠主动脉组织中VGAM-1蛋白质含量,结果显示与对照组小鼠相比,基因沉默组ApoE-/-小鼠主动脉组织中VCAM-1蛋白水平明显下降(P0.05)。3. VCAM-1基因沉默对ApoE-/-小鼠血脂的影响处死前取静脉血检测两组ApoE-/-小鼠血液中的TC、LDL-C、HDL-C及TG水平,结果表明两组小鼠间TC、LDL-C、HDL-C及TG水平无明显统计学差异(P0.05)。4. VCAM-1基因沉默对主动脉AS斑块的影响HE染色显示,VCAM-1基因沉默组小鼠主动脉AS斑块面积相比对照组显著减少(P0.05)。脂质油红O染色显示,相比对照组,ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块中的脂质含量明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。巨噬细胞MOMA-2染色显示,VCAM-1基因沉默组小鼠斑块内巨噬细胞含量相比对照组明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论：1.利用慢病毒介导的RNAi技术可以安全而有效地使ApoE-/-小鼠的VCAM-1基因沉默。2. VCAM-1基因沉默后,ApoE-/-小鼠主动脉根部AS斑块体积明显减小,且斑块内脂质含量明显减少。3. ApoE-/-小鼠动脉AS斑块内巨噬细胞减少,可能是VCAM-1基因沉默使AS病变减轻的机制。
【关键词】：人类 活体 动脉粥样硬化 血管细胞粘附分子-1 冠状动脉旁路移植术 免疫组织化学 VCAM-1 基因沉默 RNA干扰 动脉粥样硬化斑块
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 第一部分6-74
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 符号说明17-20
• 前言20-24
• 材料方法24-33
• 结果33-36
• 讨论36-50
• 结论50-51
• 创新点局限性51-52
• 附表附图52-64
• 参考文献64-74
• 第二部分74-110
• 中文摘要74-78
• 英文摘要78-81
• 前言81-83
• 材料方法83-90
• 结果90-91
• 讨论91-98
• 结论98-99
• 创新点局限性99-100
• 附表附图100-104
• 参考文献104-110
• 致谢110-111
• 在读期间发表论文111-112
• 学位论文评阅及答辩情况表112-114
• SCI文章Ⅰ114-134
• SCI文章Ⅱ134-161

【参考文献】

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1 朱平,李小鹰,石怀银,韦立新;心血管病患者尸检中主动脉粥样硬化与冠状动脉粥样硬化程度的相关性分析[J];中华心血管病杂志;2004年06期

2 周淑媛;王迎寒;巩仔鹏;阮从潇;阚晓溪;朱晓新;;颈总动脉套管法与颈外动脉结扎法建立局部低切应力动脉粥样硬化兔模型的比较[J];中国实验方剂学杂志;2013年10期

  本文关键词：动脉粥样硬化中血管细胞粘附分子-1的表达与基因干预研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：393870