非小细胞肺癌中TGF-β经典信号通路相关基因的miRNA表观调控机制

发布时间：2017-05-26 12:08

  本文关键词：非小细胞肺癌中TGF-β经典信号通路相关基因的miRNA表观调控机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究背景与目的】肺癌是全球范围内最为常见的癌症之一,其中非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)占大部分(85%)。遗传因素是肿瘤发生的重要原因。转化生长因子-beta信号通路(TGF-βsignaling pathway)能够调节从胚胎发育到组织内环境的稳态等一系列的生物功能。而TGF-β信号通路的紊乱对于非小细胞肺癌的发生和发展都起到关键的作用。该通路中各组分在癌症发生发展中的异常表达是导致TGF-β信号通路紊乱的主要原因,其中膜受体TGFβR1和转录因子SMAD4是TGF-β信号级联传递的关键蛋白。研究发现他们在非小细胞肺癌中频繁下调表达。由于二者在NSCLC中突变频率很低,所以表观机制可能是其异常表达的潜在原因之一。mi RNA在转录后水平对基因的表达起调控作用,人类中大部分基因的表达受到mi RNA的靶向直接调控。预测分析显示TGFβR1和SMAD4也可以受到mi RNA的调控,本研究旨在探讨NSCLC中TGFβR1和SMAD4异常表达的mi RNA调控机制,阐明mi RNA在NSCLC发生发展中的重要作用,为NSCLC的早期诊断和治疗提供新的思路和实验依据。【研究方法】1)实时定量荧光PCR检测m RNA和mi RNAs的表达,western blot检测蛋白的表达情况;2)双荧光报告载体技术检测mi RNA与转录本3’UTR预测位点的靶向作用关系;3)利用慢病毒载体构建技术方法培养和筛选mi R-142-3p稳定过表达和沉默细胞株;4)利用细胞计数或CCK-8细胞增殖检测技术来检测细胞的增殖能力变化;5)利用Transwell细胞迁移侵袭实验来检测细胞侵袭能力的变化;6)运用Mass ARRAY#174;飞行质谱技术定量检测分析mi R-205启动子区DNA甲基化情况。【研究内容】第一部分mi R-142-3p靶向抑制TGFβR1从而阻断TGF-β诱导的非小细胞肺癌生长抑制作用对NSCLC细胞株和组织中mi R-142-3p和TGFβR1基因的表达情况进行q RT-PCR或western blot检测分析发现,相对于正常支气管上皮细胞HBE,在NSCLC细胞株中TGFβR1 m RNA和蛋白下调表达,而mi R-142-3p上调表达;相对于癌旁组织,在NSCLC组织中TGFβR1 m RNA显著下调表达,mi R-142-3p上调表达,并且TGFβR1 m RNA与mi R-142-3p表达显著负相关。GEO芯片数据结果与本实验结果相似,表明TGFβR1与mi R-142-3p在NSCLC中差异表达是一个普遍现象,并且mi R-142-3p可能是导致TGFβR1表达下调的原因之一。通过Target Scan对TGFβR1进行预测分析,表明mi R-142-3p可能靶向作用TGFβR1 3’UTR特异序列。通过mi RNA mimics瞬时转染NSCLC细胞发现,mi R-142-3p可以显著下调TGFβR1 m RNA和蛋白表达,且其抑制物Anti-mi R-142-3p可以显著上调TGFβR1 m RNA和蛋白的表达。进一步的双荧光报告载体活性实验证实TGFβR1是mi R-142-3p直接调控的靶基因。我构建并筛选了mi R-142-3p稳定上调表达和稳定沉默的A549细胞株。进一步观察mi R-142-3p对TGF-β通路及其生物学功能的影响。实验结果表明,mi R-142-3p显著抑制了TGF-β通路活性,表现在通路中关键转录因子p-SMAD3的活性的下降。不仅如此,mi R-142-3p还阻断了TGF-β通路所诱导的细胞生长抑制作用,表现在调控细胞周期关键转录因子p21的下调表达。另一方面,mi R-142-3p抑制了TGF-β诱导的NSCLC细胞的EMT和侵袭能力。第二部分mi R-205靶向抑制SMAD4表达促进非小细胞肺癌的增殖对NSCLC组织中mi R-205和SMAD4的表达情况进行q RT-PCR检测分析发现,相对于癌旁组织,在NSCLC组织中SMAD4 m RNA显著下调表达,mi R-205显著上调表达,并且SMAD4 m RNA与mi R-205表达显著负相关。GEO芯片数据结果与本实验结果相似,表明SMAD4与mi R-205在NSCLC中差异表达较为频繁,并且mi R-205可能是导致SMAD4表达下调的原因之一。通过Target Scan对SMAD4进行预测分析,表明mi R-205可能靶向作用SMAD43’UTR特定序列。通过mi RNA mimics瞬时转染NSCLC细胞发现,mi R-205可以显著下调SMAD4 m RNA和蛋白表达,利用双荧光报告载体活性检测证实了SMAD4是mi R-205直接调控的靶基因。细胞增殖实验表明,mi R-205可以显著增强NSCLC细胞株的增殖能力,并且瞬时沉默SMAD4也可以达到相同的作用,表明mi R-205可以通过抑制SMAD4的表达来促进NSCLC细胞的增殖能力。针对mi R-205启动子区甲基化情况的检测分析发现,其-77Cp G位点的甲基化频率在NSCLC组织中显著低于癌旁组织,表明这可能是导致mi R-205在NSCLC中上调表达的原因之一。
【关键词】：非小细胞肺癌 微小RNA 转化生长因子-β
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-15
• 第二章 材料与方法15-39
• 1 材料15-21
• 1.1 细胞株15
• 1.2 临床组织样本15
• 1.3 菌株和质粒载体15-16
• 1.4 试剂16-20
• 1.5 生物信息学、统计学软件和数据库20
• 1.6 主要仪器20-21
• 2 方法21-39
• 2.1 生物信息学方法21-22
• 2.2 细胞培养22-23
• 2.3 RNA定量检测23-27
• 2.4 蛋白提取及表达检测27-29
• 2.5 载体构建29-35
• 2.6 miR1423p稳定过表达和沉默细胞株的建立35-37
• 2.7 MassArray甲基化检测37-38
• 2.8 统计学方法38-39
• 第三章实验结果39-59
• 第一部分 miR1423p靶向抑制TGFβR1从而阻断TGF-β诱导的非小细胞肺癌生长抑制作用39-52
• 1.1 TGFβR1与miR1423p在NSCLC细胞与组织中的表达情况39-43
• 1.2 miR1423p靶向抑制TGFβR143-46
• 1.3 miR1423p对TGF-β/SMAD经典信号通路的抑制作用46-48
• 1.4 miR1423p对TGF-β诱导的NSCLC细胞增殖抑制作用的影响48-50
• 1.5 miR1423p对TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT的影响50-51
• 1.6 小结51-52
• 第二部分 miR-205靶向抑制SMAD4表达促进非小细胞肺癌的增殖52-59
• 2.1 SAMD4与miR-205在NSCLC中的表达情况52-54
• 2.2 miR-205靶向抑制SMAD454-56
• 2.3 miR-205通过抑制SMAD4表达来促进NSCLC细胞的增殖56-57
• 2.4 NSCLC中miR-205高表达与其启动子区低甲基化频率相关57-58
• 2.5 小结58-59
• 第四章讨论59-62
• 全文总结62-63
• 参考文献63-70
• 综述70-87
• 参考文献78-87
• 攻读博士期间发表论文87-88
• 附录：英文缩略词表88-90
• 致谢90-91

【参考文献】

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1 陈万青;张思维;曾红梅;郑荣寿;邹小农;赵平;吴良有;李光琳;赫捷;;中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J];中国肿瘤;2014年01期

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本文编号：396752