癌细胞片状伪足形成的恶性行为表型及其分子机制

发布时间：2017-05-26 15:19

  本文关键词：癌细胞片状伪足形成的恶性行为表型及其分子机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：癌症的恶性程度与癌细胞的恶性行为表型密切相关,癌细胞有三个基本表型特征:不死性、迁移性和失去接触抑制。当然,癌细胞还有许多不同于其他正常细胞的生理、生化和形态特征,如异倍体、代谢异常、耐药等等。其中癌细胞的迁移性是其常见的恶性表型之一,而癌细胞的迁移能力直接决定了其恶性的程度。癌细胞迁移涉及到细胞粘附的减少、细胞骨架的重排、细胞外基质的降解和细胞突出及伪足的形成,其中癌细胞的伪足尤其是片状伪足的形成是癌细胞迁移能力强弱的关键所在。伪足一般划分为丝状伪足、片状伪足、侵袭伪足和足体。作为细胞膜的特化结构,这四种伪足有着不同的功能:丝状伪足主要负责细胞粘附,而片状伪足对于细胞的长距离迁移有着重要的作用。HAb18G/CD147分子作为一个肿瘤标志物,高表达于多种癌细胞表面。已有多篇文献报道HAb18G/CD147分子对癌细胞的侵袭转移有着重要的影响,但其具体的影响机制还有待进一步的阐明。因此,为了进一步了解HAb18G/CD147分子与癌细胞恶性行为表型尤其是癌细胞的侵袭转移能力的关系,是否通过改变癌细胞伪足形成来调节癌细胞的运动,我们利用多种细胞生物学及分子生物学手段,证明了HAb18G/CD147分子通过Fak和Src的磷酸化使Cortactin分子活化,活化的Cortactin分子能够作为支架蛋白维持Arp2/3复合物的稳定,进一步促使Actin在细胞前缘(Leading-edge)形成树突状网络结构即片状伪足,最终促进癌细胞运动能力。本研究最终阐明了HAb18G/CD147促进癌细胞转移的分子生物学机制。第一部分:HAb18G/CD147促进癌细胞片状伪足的形成介导癌细胞的转移HAb18G/CD147早已被多篇文献证明能够影响癌细胞的侵袭转移,不论是干涉HAb18G/CD147分子的表达,还是通过抗体特异的封闭HAb18G/CD147分子的功能,都能够抑制癌细胞的侵袭转移能力。但是对于HAb18G/CD147分子怎样促进癌细胞侵袭转移,还有待深入阐述。首先,为了确认HAb18G/CD147对癌细胞侵袭转移能力的影响,我们利用稳定干涉HAb18G/CD147的癌细胞系(knock down)和HAb18G/CD147基因敲除的癌细胞系(knock out),transwell实验发现降低或敲除HAb18G/CD147表达能够显著抑制癌细胞的迁移能力。细胞轨迹追踪实验证实,HAb18G/CD147表达下降能够显著下调癌细胞的运动速率。这些实验都提示我们HAb18G/CD147表达变化能够显著影响癌细胞的运动能力。进一步利用高分辨率的激光共聚焦显微镜通过活细胞划痕实验观察细胞运动过程,结果发现与对照组相比,低表达HAb18G/CD147的癌细胞在运动过程中片状伪足形成明显很少,免疫荧光染色实验确认了此结果。本部分的研究结论:HAb18G/CD147表达下降能够显著降低癌细胞的运动能力,而这种影响的主要表现就是癌细胞片状伪足形成的减少。第二部分:HAb18G/CD147影响癌细胞片状伪足形成的分子机制为了揭示HAb18G/CD147促进癌细胞片状伪足形成的分子机制,我们首先利用第一部分构建的HAb18G/CD147稳转干涉的癌细胞系(knock down)和HAb18G/CD147基因敲除癌细胞系(knock out),通过蛋白免疫印迹实验检测了与片状伪足形成相关分子的表达水平,结果发现HAb18G/CD147表达下降并没有影响片状伪足形成相关分子的表达水平,却影响了Fak、Src和Cortactin的酪氨酸磷酸化水平。使用荧光共振能量转移实验分别检测HAb18G/CD147、Fak、Src和Cortactin之间的两两相互作用,结果发现HAb18G/CD147与Fak、Fak与Src、Src与Cortactin分别能够两两相互作用。进一步通过点突变Cortactin的酪氨酸位点,活细胞实时观察及侵袭小室实验确定了Cortactin的酪氨酸磷酸化是片状伪足形成的关键。通过以上结果我们得出结论:HAb18G/CD147表达促进癌细胞片状伪足的形成是通过HAb18G/CD147、Fak、Src和Cortactin分子间的逐级磷酸化来实现的。第三部分:HAb18G/CD147促进癌细胞转移的体内研究本部分研究的目的是通过一系列的动物实验在体内证明HAb18G/CD147对癌细胞转移的影响,以及通过收集临床病例,分析HAb18G/CD147与癌症病人的TNM分期的关系。我们通过经尾静脉注射癌细胞的方法构建裸鼠转移模型,到达时间点处死解剖裸鼠,取肺脏及肝脏进行HE染色,发现HAb18G/CD147对于癌细胞的肝脏转移有显著影响;通过双光子显微镜观察也印证了这一结果,这些体内实验结果都提示我们HAb18G/CD147对癌细胞转移的影响。另外,我们又通过收集临床病例,分析了HAb18G/CD147与癌症病人的TNM分期的关系,结果发现HAb18G/CD147与癌症病人的TNM分期有相关性;这些临床病例分析结果也证明HAb18G/CD147分子促进了癌的进展。综上所述,HAb18G/CD147的表达变化能够显著促进癌细胞的运动能力,而这种影响的主要表现就是能够影响癌细胞片状伪足的形成。并且HAb18G/CD147表达变化促进癌细胞的片状伪足形成是通过HAb18G/CD147、Fak、Src及Cortactin分子间的逐级磷酸化来实现的。体内实验结果及临床病例分析结果也证明HAb18G/CD147促进了癌的进展。
【关键词】：癌细胞 片状伪足 HAb18G/CD147 Cortactin Fak Src 细胞运动 细胞前缘
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-33
• 第一部分 HAB18G/CD147促进癌细胞片状伪足的形成介导癌细胞的转移33-52
• 引言33
• 1 材料33-37
• 1.1 主要实验器材33-34
• 1.2 主要实验试剂34-35
• 1.3 主要缓冲液35-36
• 1.4 细胞系36-37
• 2 方法37-41
• 2.1 肿瘤细胞的培养37
• 2.2 蛋白质印迹实验37-38
• 2.3 肿瘤细胞增殖活力检测实验38-39
• 2.4 流式细胞术检测肿瘤细胞增周期实验39
• 2.5 transwell侵袭小室检测细胞迁移能力实验39-40
• 2.6 活细胞培养观察细胞运动轨迹实验40
• 2.7 活细胞培养观察细胞片状伪足形成能力实验40
• 2.8 免疫荧光染色观察片状伪足形成及定位实验40-41
• 2.9 数据统计分析41
• 3 结果41-50
• 4 讨论50-52
• 第二部分 HAB18G/CD147影响癌细胞片状伪足形成的分子机制52-75
• 引言52
• 1.材料52-55
• 1.1 主要实验器材52-53
• 1.2 主要实验试剂53-54
• 1.3 主要缓冲液54-55
• 1.4 主要质粒载体55
• 2.方法55-66
• 2.1 蛋白质印记实验55-56
• 2.2 荧光蛋白质粒小量提取实验56-57
• 2.2 提取人肿瘤细胞内Total RNA57-58
• 2.3 total RNA反转录成c DNA58-59
• 2.4 基因扩增引物的设计和PCR反应（以Cortactin为例）59-60
• 2.5 琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物60-61
• 2.6 Cortactin的PCR和T-vector连接61-62
• 2.7 Dsred1-N1载体、p EGFP载体与Cortactin T载体的酶切连接62-64
• 2.8 连接产物的转化、挑单克隆及鉴定64
• 2.9 si RNA干涉64-65
• 2.10 荧光能量共振转移实验（以HAb18G/CD147与Cortactin为例）65
• 2.11 Cortactin荧光表达载体点突变实验65-66
• 2.12 数据统计分析66
• 3.结果66-73
• 4.讨论73-75
• 第三部分 HAB18G/CD147促进癌细胞转移的体内研究及其临床意义75-85
• 引言75
• 1.材料75-76
• 1.1 主要实验器材75-76
• 1.2 主要实验试剂76
• 1.3 主要缓冲液76
• 2.方法76-79
• 2.1 尾静脉注射癌细胞构建裸鼠转移模型实验76-77
• 2.2 HE染色实验77-78
• 2.3 免疫组化染色实验78
• 2.4 双光子显微镜直接观察裸鼠肝脏转移灶78
• 2.5 临床样本免疫组化染色结果评分判定78-79
• 2.6 临床样本统计分析79
• 3.结果79-84
• 4.讨论84-85
• 小结85-86
• 参考文献86-95
• 个人简历和研究成果95-97
• 致谢97

  本文关键词：癌细胞片状伪足形成的恶性行为表型及其分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：397253