泛素连接酶MDM2对调节性T细胞稳定性的调控以及能量感受器AMPK在调节性T细胞中的功能机理研究
发布时间：2024-05-30 05:58
调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells)在维持机体的免疫耐受与免疫平衡等方面发挥着尤为重要的作用。叉头框P3蛋白(forkhead box P3,FOXP3)是Treg细胞关键的转录因子并且对Treg细胞的免疫抑制功能非常重要。转录因子FOXP3受多方面的调控,例如转录调控,蛋白复合体的调控,以及翻译后修饰水平上的调控,共同完善了Treg细胞的发育与功能机制。其中,FOXP3蛋白的翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化与泛素化,影响着FOXP3与Treg细胞的稳定性与功能。近年来研究发现多个泛素连接酶或去泛素化酶调控FOXP3蛋白K48位多聚泛素化修饰,从而影响FOXP3蛋白与Treg细胞的功能,但我们对于FOXP3蛋白发生的其它类型的泛素化修饰却知之甚少。由于发生的位点与类型的不同,泛素化修饰不仅造成蛋白降解,也可能稳定蛋白的功能,因此,还有其它调控FOXP3蛋白泛素化修饰的酶有待发现。泛素连接酶MDM2(murine double minute 2)介导抑癌蛋白p53的泛素化修饰并使其降解,最近研究发现它也能负调控T细胞的激活,但它是否调控Treg细胞的功能...
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1 调节性T细胞的简介
1.2 Treg细胞的发育
1.3 Treg细胞发挥免疫抑制功能的机制
1.3.1 抑制性细胞因子
1.3.2 细胞裂解作用
1.3.3 代谢紊乱
1.3.4 靶向树突状细胞的抑制作用
1.4 Treg细胞转录因子FOXP3 的调控机制
1.4.1 FOXP3 的转录调控
1.4.2 FOXP3 蛋白复合体
1.4.3 FOXP3 的翻译后修饰调控
1.5 MDM2 蛋白与功能
1.6 AMPK蛋白与功能
第2章 材料与方法
2.1 抗体与试剂
2.1.1 抗体
2.1.2 试剂
2.2 质粒与引物
2.3 实验动物
2.4 细胞培养
2.4.1 培养基的配制
2.4.2 细胞系的培养
2.4.3 人原代Treg细胞的培养
2.5 在人血中分离PBMC
2.6 从小鼠脾脏、淋巴结和胸腺中分离淋巴细胞
2.7 富集CD4+T 细胞
2.7.1 人源CD4+T 细胞
2.7.2 小鼠来源的CD4+T 细胞
2.8 原代细胞的分选
2.9 流式染色
2.10 人源Treg细胞的免疫抑制实验
2.11 慢病毒的包装、纯化与富集
2.11.1 慢病毒的包装
2.11.2 慢病毒的纯化与富集
2.12 慢病毒感染细胞
2.12.1 慢病毒感染人原代Treg细胞
2.12.2 慢病毒感染人原代Teff细胞
2.12.3 慢病毒感染Jurkat细胞系
2.13 RNA的抽提,反转录与实时定量PCR
2.13.1 RNA的抽提
2.13.2 反转录
2.13.3 实时定量PCR
2.14 HEK293T细胞的转染
2.15 免疫共沉淀
2.15.1 外源免疫共沉淀
2.15.2 内源免疫共沉淀
2.16 悬浮细胞的免疫荧光实验
2.16.1 试剂的准备
2.16.2 实验过程
2.17 His-pull-down实验
2.17.1 缓冲液的配制
2.17.2 实验过程
2.18 体外泛素化修饰实验
2.19 免疫印迹实验
2.20 小鼠饥饿与甲型流感病毒感染模型
2.21 小鼠肺中淋巴细胞的分离
2.22 统计学分析
第3章 实验结果
3.1 泛素连接酶MDM2 通过泛素化转录因子FOXP3 正调控Treg细胞的功能
3.1.1 泛素连接酶MDM2 正调控人原代Treg细胞的功能
3.1.2 泛素连接酶MDM2 调控关键转录因子FOXP3 的蛋白水平
3.1.3 MDM2 稳定FOXP3 蛋白的表达依赖于其泛素连接酶活性
3.1.4 泛素连接酶MDM2 能够与转录因子FOXP3 发生相互作用
3.1.5 泛素连接酶MDM2 能对FOXP3 蛋白进行泛素化修饰
3.1.6 泛素连接酶MDM2 介导FOXP3 蛋白的多个位点发生泛素化修饰
3.1.7 TCR/CD28 信号促进Treg细胞中MDM2 表达水平的升高
3.1.8 过表达MDM2 蛋白增强人原代Treg细胞的功能
3.2 对蛋白激酶AMPK在 Treg细胞中发挥功能的探索
3.2.1 蛋白激酶AMPK能够与转录因子FOXP3 相互作用
3.2.2 AMPK在 Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠的Treg细胞中被特异性敲除
3.2.3 Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠没有表现出T细胞的过度活化
3.2.4 Treg细胞中AMPK的缺失不影响Teff细胞产生细胞因子与Treg细胞的比例
3.2.5 Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠能够抵抗饥饿处理导致的T细胞来源细胞因子的减少
3.2.6 甲型流感病毒感染后,Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠没有明显的表型
3.2.7 与Foxp3YFP-Cre小鼠相比,饥饿刺激的Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠更容易被甲型流感病毒感染
第4章 总结与讨论
参考文献
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
专业综述
References
本文编号：3984651
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1 调节性T细胞的简介
1.2 Treg细胞的发育
1.3 Treg细胞发挥免疫抑制功能的机制
1.3.1 抑制性细胞因子
1.3.2 细胞裂解作用
1.3.3 代谢紊乱
1.3.4 靶向树突状细胞的抑制作用
1.4 Treg细胞转录因子FOXP3 的调控机制
1.4.1 FOXP3 的转录调控
1.4.2 FOXP3 蛋白复合体
1.4.3 FOXP3 的翻译后修饰调控
1.5 MDM2 蛋白与功能
1.6 AMPK蛋白与功能
第2章 材料与方法
2.1 抗体与试剂
2.1.1 抗体
2.1.2 试剂
2.2 质粒与引物
2.3 实验动物
2.4 细胞培养
2.4.1 培养基的配制
2.4.2 细胞系的培养
2.4.3 人原代Treg细胞的培养
2.5 在人血中分离PBMC
2.6 从小鼠脾脏、淋巴结和胸腺中分离淋巴细胞
2.7 富集CD4+T 细胞
2.7.1 人源CD4+T 细胞
2.7.2 小鼠来源的CD4+T 细胞
2.8 原代细胞的分选
2.9 流式染色
2.10 人源Treg细胞的免疫抑制实验
2.11 慢病毒的包装、纯化与富集
2.11.1 慢病毒的包装
2.11.2 慢病毒的纯化与富集
2.12 慢病毒感染细胞
2.12.1 慢病毒感染人原代Treg细胞
2.12.2 慢病毒感染人原代Teff细胞
2.12.3 慢病毒感染Jurkat细胞系
2.13 RNA的抽提,反转录与实时定量PCR
2.13.1 RNA的抽提
2.13.2 反转录
2.13.3 实时定量PCR
2.14 HEK293T细胞的转染
2.15 免疫共沉淀
2.15.1 外源免疫共沉淀
2.15.2 内源免疫共沉淀
2.16 悬浮细胞的免疫荧光实验
2.16.1 试剂的准备
2.16.2 实验过程
2.17 His-pull-down实验
2.17.1 缓冲液的配制
2.17.2 实验过程
2.18 体外泛素化修饰实验
2.19 免疫印迹实验
2.20 小鼠饥饿与甲型流感病毒感染模型
2.21 小鼠肺中淋巴细胞的分离
2.22 统计学分析
第3章 实验结果
3.1 泛素连接酶MDM2 通过泛素化转录因子FOXP3 正调控Treg细胞的功能
3.1.1 泛素连接酶MDM2 正调控人原代Treg细胞的功能
3.1.2 泛素连接酶MDM2 调控关键转录因子FOXP3 的蛋白水平
3.1.3 MDM2 稳定FOXP3 蛋白的表达依赖于其泛素连接酶活性
3.1.4 泛素连接酶MDM2 能够与转录因子FOXP3 发生相互作用
3.1.5 泛素连接酶MDM2 能对FOXP3 蛋白进行泛素化修饰
3.1.6 泛素连接酶MDM2 介导FOXP3 蛋白的多个位点发生泛素化修饰
3.1.7 TCR/CD28 信号促进Treg细胞中MDM2 表达水平的升高
3.1.8 过表达MDM2 蛋白增强人原代Treg细胞的功能
3.2 对蛋白激酶AMPK在 Treg细胞中发挥功能的探索
3.2.1 蛋白激酶AMPK能够与转录因子FOXP3 相互作用
3.2.2 AMPK在 Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠的Treg细胞中被特异性敲除
3.2.3 Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠没有表现出T细胞的过度活化
3.2.4 Treg细胞中AMPK的缺失不影响Teff细胞产生细胞因子与Treg细胞的比例
3.2.5 Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠能够抵抗饥饿处理导致的T细胞来源细胞因子的减少
3.2.6 甲型流感病毒感染后,Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠没有明显的表型
3.2.7 与Foxp3YFP-Cre小鼠相比,饥饿刺激的Foxp3CrePRKAA1fl/flPRKAA2fl/fl小鼠更容易被甲型流感病毒感染
第4章 总结与讨论
参考文献
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
专业综述
References
本文编号：3984651
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3984651.html
教材专著
