NEK2与前列腺癌侵袭性和预后的相关研究

发布时间：2017-05-27 11:15

  本文关键词：NEK2与前列腺癌侵袭性和预后的相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的：中心体是人类细胞的微管组织中心,在有丝分裂纺锤体的形成和染色体分离起到关键作用。有研究显示各种各样组织来源的癌细胞通常表现出与中心体数目或结构相关的多极纺锤体。而一些位于中心体的细胞周期调节蛋白激酶,是有丝分裂进程和形成正确双极纺锤体所必需的。目前公认的中心体相关激酶是NEK2,它有两种剪接变体NEK2A和NEK2B。它们的表达调控细胞周期。NEK2是活性的丝氨酸和苏氨酸激酶,磷酸化多种参与中心体复制和细胞周期调控蛋白质。其结合微管,在中心体含量丰富,有助于中心体在细胞周期的G2/M期分裂。异常NEK2活动因未能调节中心体复制,从而导致非整倍体,这些都是肿瘤发生的影响因素。目前已经证实包括乳腺癌、肺癌、睾丸癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤等人类肿瘤中NEK2表达水平增高。NEK2在非转化的乳腺上皮细胞中过表达会导致中心体过度复制。内源性NEK2表达增加导致乳腺癌细胞的中心体扩增并表达致癌的K-ras。从目前的研究来看,NEK2在癌细胞中经常存在表达的明显升高。虽然在肿瘤细胞中观察到了NEK2的增量调节和基因不稳定性,但是NEK2的上调在前列腺癌作用仍不明确。在这项研究中,我们调查了人类前列腺癌组织芯片的NEK2表达模式和抑制NEK2的表达对前列腺癌细胞增殖功能的改变。结果显示NEK2的表达与前列腺癌患者的预后密切相关。总之,NEK2过度表达可以预测前列腺癌复发。材料和方法：患者及组织：该研究得到广州医科大学广州市第一人民医院的伦理委员会批准。所有的患者都签署知情同意。所有标本均按照道德和法律标准进行匿名处理。免疫组化分析使用组织芯片购自上海(Shanghai Outdo Biotech Co, LTD (Cat No:HPro-Ade180PG-01),该芯片包含99例前列腺原位癌组织及81例前列腺癌旁组织,附带患者相应的临床信息,且所有患者术前均没有接受过化疗及放疗。Taylor数据库包含149例接受前列腺癌根治术病人的前列腺癌组织和29例癌旁良性组织的mRNAs表达水平,对应患者总体生存时间和术后1至175个月(平均51个月)的后续检查等详细临床资料。前列腺癌根治术的日期被视为生存分析的第一天。PSA复发被认为是无生化复发终点。除了意外原因,死亡被认为是总生存期的终点。细胞培养,转染和处理细胞增殖实验是把2×103个细胞接种到96孔板,培养24小时,48小时和72小时后每孔加CCK8溶液(Cat No:C0038, Beyotime, China) 20ul,37℃继续孵育4小时,终止培养。每孔选择495nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,结果用均数±标准差表示。RNA的干扰,按照说明书的方法用siRNA转染细胞,然后培养培养24小时,48小时和72小时再行检测分析。QRT-PCR使用TRIzol法从前列腺癌细胞和组织中提取RNA,然后逆转录。所有数据用Opticon Monitor software(ver3.1, Bio-Rad)分析。Western blotting转染48小时后提取蛋白。取40μg蛋白质样品进行SDS—PAGE凝胶电泳后将凝胶上的蛋白转移至膜上.标记预染的位置。5%脱脂牛奶封闭,并加入NEK2抗体(bs-5732R, Bioss Co Ltd.,China)和β-actin抗体(sc-47778,Santa Cruz, USA)。肿瘤种植平均6-8周的裸鼠在广州医科大学动物实验中心动物实验中心饲养。0.1ml培养液里2×10 6个细胞与等量的Matrigel(货号：356234, BD Biosciences)充分混合,灭菌。转染了NEK2 siRNA的LNCaP细胞株注射在裸鼠的左侧,对照的细胞注射在裸鼠的右侧。我们使用卡尺测量肿瘤,并在三个不同的时间点计算出的肿瘤的大小,然后在植入细胞43天后收集肿瘤组织进行检测。免疫组化标本在10%福尔马林固定,随后包埋在石蜡中。石蜡包埋的组织切成4微米的厚度,然后脱蜡行HE染色或免疫组织化学染色。简要地说,切片加入1：400NEK2抗体(bs-5732R,Bioss Co Ltd., China) 4℃培养过夜。随后洗涤,用过氧化物标记的多聚物及色原体基质处理以发现目标蛋白的染色情况,在整个免疫组化实验中,空白对照不加一抗处理。在苏木素复染后,两位有经验的病理实验工作者各自独立对组织的免疫染色进行评分,且这两位工作者对患者的临床病理报告及预后完全不知情。随后对两组评分数据进行比较,任何有差异评分的切片都要进行重新评估,当两位工作人员的评分一致时,癌细胞的免疫标记评估才完成。取十个典型的显微镜下视野并数出阳性染色细胞数,计算出阳性细胞比例。根据染色细胞的比例采取半定量的方式分成4组：0(0%),1(1-10%),2(11-50%),and 3(50%).染色强度进行视觉计评分：0(阴性),1(弱),2(中度)和3(强)。最后染色细胞比例评分及染色深度评分相乘构成了最终的免疫组化评分(IRS)。统计学处理：数据分析采用SPSSS13.0软件(Version 13.0 for Windows, SPSS Inc.,IL,USA)和SAS9.1软件(SAS Institute,Cary, NC, USA)。连续性变量资料采用X±s表示,One-way ANOVA检验分析各细胞株中NEK2的表达情况,如有差异再用LSD等方法做两两比较；两独立样本t检验分析NEK2 mRNA在LNCaP scrumble细胞和siNEK2 LNCaP细胞的表达情况；Two-way ANOVA检验分析细胞增殖实验的数据和裸鼠不同时间点皮下移植瘤的体积；Pearson卡方检验分析它们在前列腺癌与前列腺增生组织中的免疫组化染色情况,两独立样本t检验分析它们在前列腺癌组织中的免疫组化评分与前列腺癌患者临床病理参数之间的关系,Kaplan-Meier法估计总体生存率、无转移生存率、无生化复发生存率和总体生存率,并采用log-rank对两组进行比较。P0.05为差异具有统计学意义。结果NEK2在各种前列腺细胞株中的基因表达情况运用实时定量RT-PCR法在mRNA水平评估3种人类前列腺癌细胞株(PC3、LNCaP和DU145)和1种人类正常前列腺上皮细胞株(PrEC)NEK2的表达情况。结果发现相对PrEC, NEK2在PC3、LNCaP和DU145三种前列腺癌细胞株中均有表达量增加(P0.01)。NEK2促进前列腺癌细胞的增殖为了确定高表达NEK2是否促成细胞增殖,利用siRNA技术构建NEK2表达下调的LNCaP细胞。实时定量RT-PCR和Western blot分析表明NEK2在LNCaP细胞株中的mRNA表达和蛋白水平明显下降。随后细胞增殖实验显示,抑制了NEK2基因的LNCaP细胞生长速度显著慢于对照组。这结果表明,NEK2过表达可促进前列腺癌细胞增殖。敲除NEK2基因的表达抑制了前列腺癌LNCaP细胞的侵袭性为了明确抑制NEK2表达对前列腺癌LNCaP细胞的侵袭性的影响,我们把转染了siRNA的LNCaP细胞和对照细胞种植到同一个裸鼠的两侧。在种植后的14、23、36天测量肿瘤的大小,siNEK2细胞种植侧形成的肿瘤体积明显缩小。在植入细胞43天后收集肿瘤组织进行检测。与对照组的肿瘤比较,沉默NEK2的肿瘤不但比较小,颜色还比较淡,这表明肿瘤血管生成也被受到影响。免疫组化染色结果显示,在siNEK2转染的LNCaP细胞移植肿瘤中,NEK2表达明显下调。而在400倍放大背景下,可以清楚看到NEK2蛋白主要表达在细胞核和细胞间质中。NEK2在前列腺癌的临床病理特征为进一步明确NEK2在前列腺癌组织中的表达模式及定位,对购买于上海芯超生物有限公司的含有99例前列腺癌及81例癌旁前列腺组织的组织芯片进行免疫组化染色检测。在癌旁前列腺组织中NEK2免疫组化染色较弱或没有。NEK2在前列腺癌细胞中染色强,且主要位于细胞质和细胞核。与前列腺癌Gleason评分8的组织相比较,Gleason评分-8的组织NEK2的表达量明显增高。另外,前列腺癌临床病理分期高的组织,NEK2表达增加。分析Tylor数据与我们组织芯片的结论相符。运用Kaplan meier方法分析NEK2表达水平跟前列腺癌接受外科根治术后生化复发生存率、总体生存率的相关性。以NEK2表达量的中位数为分割点将前列腺癌组织分为高表达组(80例)和低表达组(80例)。在生化复发时间上,高表达组明显比低表达组更早地出现了生化复发,但NEK2高表达组和低表达组在前列腺癌总体生存率上没有明显区别。结论：我们的研究首次证明了NEK2的过度表达与前列腺癌的进展相关,这也表明,NEK2能够作为判断前列腺癌预后的潜在生物学标志物。
【关键词】：NEK2 前列腺癌 生物学标志物 siRNA
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 前言17-52
• 1.1 前列腺的概述17-23
• 1.2 前列腺癌的现状23-26
• 1.3 前列腺癌的发病机制26-31
• 1.3.1 肿瘤发生的分子生物学基础26-27
• 1.3.2 前列腺癌发生、发展27-31
• 1.4 前列腺癌诊断31-34
• 1.4.1 前列腺癌早期诊断31-33
• 1.4.2 前列腺癌晚期诊断33-34
• 1.5 前列腺癌GLEASON评分标准34-39
• 1.6 前列腺癌分期39-43
• 1.6.1 临床分期39-42
• 1.6.2 病理分期42-43
• 1.7 前列腺癌治疗43-47
• 1.7.1 保守治疗43
• 1.7.2 根治性前列腺切除术43-44
• 1.7.3 放射疗法44
• 1.7.4 其它疗法44-45
• 1.7.5 前列腺癌术后生化复发与治疗45-46
• 1.7.6 前列腺癌术治疗的难点46-47
• 1.8 NEK2的功能及研究进展47-51
• 1.8.1 NEK2的发现、基本结构和定位47-48
• 1.8.2 NEK2在细胞分裂中的功能48-49
• 1.8.3 NEK2与肿瘤49-51
• 1.9 本研究拟解决的问题51-52
• 第二章 材料与方法52-69
• 2.1 材料52-55
• 2.1.1 组织来源及临床资料52
• 2.1.2 动物52
• 2.1.3 细胞株52-55
• 2.2 方法55-69
• 2.2.1 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)55-61
• 2.2.2 Short interfering RNA(siRNA)筛选转染方案61-62
• 2.2.3 细胞增殖实验(CCK-8 assay)62-63
• 2.2.4 Western Blot63-65
• 2.2.5 建立裸鼠移植瘤模型65
• 2.2.6 免疫组化染色65-68
• 2.2.7 统计学处理68-69
• 第3章 结果69-83
• 3.1 NEK2在各种前列腺细胞株中的基因表达情况69-70
• 3.2 NEK2促进前列腺癌的增殖70-73
• 3.3 体内实验证明NEK2促进肿瘤生长73-77
• 3.4 NEK2在前列腺癌的临床病理特征77-80
• 3.5 NEK2的低水平表法与前列腺痛预后差有关80-83
• 第四章 讨论83-88
• 结论88-89
• 参考文献89-100
• 第五章 综述100-121
• 参考文献114-121
• 缩略词表121-123
• 致谢123-125
• 统计学证明125

  本文关键词：NEK2与前列腺癌侵袭性和预后的相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：399775