邻苯二甲酸二丁酯免疫检测方法的建立及在大鼠模型中的应用

发布时间：2017-05-27 14:11

  本文关键词：邻苯二甲酸二丁酯免疫检测方法的建立及在大鼠模型中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是酞酸酯类化合物(Phthalate Esters, PAEs)的一种,在现代工业生产和加工中应用面相当的广。其用途主要有增塑剂、胶黏剂、润滑剂等。DBP是通过非共价键的方式与其他化合物进行连接的,稳定性不高,会在加工和使用的过程中,慢慢释放到环境中,对人和环境具有潜在的危害。DBP主要是通过吸入、皮肤接触、食入等多种途径进入人体,有时候医学注射可以成为一种高危险度的暴露方式。摄入的DBP借助摄入与排泄动态平衡的方式在人体内长时间的累积。研究表明,DBP是一种内分泌干扰物,具有生殖毒性、发育毒性以及致癌等危害。现今,针对DBP的检测技术有许多种,但主流的方法还是气相色谱-质谱联用(Gas chromatography coupled mass spectrometry, GC-MS) 和高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)。但是,这两种方法操作难度大,检测费用高,对设备的要求也高,检测过程耗时,不能实现大量样品的同时检测。因此,建立更好的DBP检测技术,用以了解人体摄入的DBP在机体内的分布和累积情况是人类迫切需要解决的问题。本研究主要分为三个部分。第一部分研究是建立检测DBP的酶联免疫吸附分析技术(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。本研究成功制备出能稳定分泌DBP单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其进行克隆化扩大培养,成功筛选出高效价和高亲和力的DBP单抗,建立了间接竞争ELISA的DBP检测技术。此技术操作方便,成本费用较低,同时本研究还对ELISA检测中的几种重要反应条件进行了优化筛选,并在最优条件下建立了间接竞争ELISA标准曲线：y=15.401Ln(X)-24.13,R2=0.9973。DBP浓度和抑制率之间呈现良好线性关系。第二部分研究是将所开发的DBP单克隆抗体ELISA检测方法用于生物样品的检测。本实验采用口腔灌胃和皮肤涂抹两种染毒方式,对大鼠进行DBP暴露,两种方式的DBP暴露浓度均为200mg/kg/D。连续暴露一周后,在24h、48h、72h时间间隔后,分别处死各组大鼠,利用ELISA检测技术,检测DBP在大鼠体内肝脏、肾脏、血液、尿液的含量。结果表明,经口腔灌胃染毒处理的大鼠体内DBP含量高于皮肤涂抹组,两种暴露方式之间,实验组与空白对照组之间皆存在极显著差别(p0.01)。随着暴露后间隔时间的延长,大鼠体内各器官组中的DBP含量逐渐减少,在72h时间间隔后,DBP残留量只有微量,说明大鼠体内的DBP会随时问逐渐被代谢掉,并通过尿液排出体外。第三部分研究在ELISA检测技术的基础上,建立了免疫荧光检测技术。本研究采用皮肤涂抹的方式对大鼠进行暴露染毒,染毒浓度为200mg/kg,空白组用玉米油进行暴露染毒。对大鼠进行一周的DBP连续暴露,在暴露后的24h、48h、72h时间节点,处死各组大鼠,取大鼠肝脏、肾脏、胃、睾丸等器官,制作冰冻切片,然后利用免疫荧光技术,结合DBP单抗的制备,检测DBP在各器官的分布和累计情况。免疫荧光技术采用双标记,可以从视觉上展示DBP在机体内的分布和累积情况,结果显示DBP在皮下组织如汗腺和毛囊中出现累积情况,在肝和肾中的累积量较大,还发现DBP可以穿透大鼠的生物屏障进入睾丸中。在通过对大鼠暴露后的24h、48h、72h体内DBP的残留量检测,发现通过皮肤涂抹暴露后,大鼠体内的DBP会在2-3内迅速代谢并排出。
【关键词】：邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 单克隆抗体 生物累积 器官组织分布 免疫荧光技术 酶联免疫吸附分析(ELISA)
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R-332;R446.6
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 综述14-36
• 1.1 研究背景14
• 1.2 研究对象14-15
• 1.3 酞酸酯类化合物的介绍15-19
• 1.4 邻苯二甲酸二丁酯的理化特性和作用19
• 1.5 DBP的多种暴露方式19-22
• 1.6 DBP的危害22-25
• 1.7 DBP在人体内的代谢25-26
• 1.8 常见的检测PAES的方法26-30
• 1.8.1 免疫分析法26-27
• 1.8.2 色谱法27-30
• 1.9 有机小分子酶联免疫吸附技术30-34
• 1.9.1 人工抗原的制备31-32
• 1.9.2 抗体的制备32-34
• 1.10 选题的目的和意义34-36
• 第二章 DBP-MAB的制备及ELISA检测技术的建立36-64
• 2.1 实验材料36-37
• 2.1.1 实验细胞36
• 2.1.2 实验试剂36
• 2.1.3 实验溶剂36-37
• 2.1.4 实验仪器37
• 2.2 实验方法37-49
• 2.2.1 半抗原的合成和结构鉴定37-38
• 2.2.2 人工抗原的合成及结构鉴定38-39
• 2.2.3 小鼠免疫方案39-40
• 2.2.4 抗血清效价的测定40-41
• 2.2.5 抗血清灵敏度的检测41-42
• 2.2.6 MAB的制备与纯化42-45
• 2.2.7 单抗的纯化45-47
• 2.2.8 人工抗原包被的ELISA检测方法的优化与建立47-49
• 2.2.9 单抗特异性检测49
• 2.3 数据分析49
• 2.4. 实验结果49-61
• 2.4.1 半抗原结构的鉴定49
• 2.4.2 人工抗原结构的鉴定49-51
• 2.4.3 抗血清效价51
• 2.4.4 抗血清灵敏度51-52
• 2.4.5 杂交瘤细胞株的建立52-53
• 2.4.6 单克隆抗体的纯化53-54
• 2.4.7 icELISA反应条件的优化54-58
• 2.4.8 人工抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立58-60
• 2.4.9 单抗特异性的检测60-61
• 2.5 讨论61-64
• 2.5.1 细胞冻存与复苏61
• 2.5.2 杂交瘤细胞的克隆化扩大筛选61-62
• 2.5.3 icELISA操作的重要细节62
• 2.5.4 ELISA显示反应62-64
• 第三章 间接竞争ELISA法检测大鼠体内的DBP64-77
• 3.1 实验材料64-65
• 3.1.1 实验动物64
• 3.1.2 实验溶剂64-65
• 3.1.3 实验仪器65
• 3.2 实验方法65-68
• 3.2.1 环境样品中DBP残留检测原理65
• 3.2.2 DBP染毒液的配制65
• 3.2.3 DBP暴露方式65-66
• 3.2.4 实验步骤66-68
• 3.2.5 MBP对DBP抑制率68
• 3.3 数据分析68-69
• 3.4 实验结果69-74
• 3.4.1 DBP标准曲线69-70
• 3.4.2 肝中DBP含量的检测70-71
• 3.4.3 肾中DBP含量的检测71-72
• 3.4.4 血液中DBP含量的检测72-73
• 3.4.5 尿液中DBP含量的检测73-74
• 3.4.6 MBP对DBP抑制率74
• 3.5. 讨论74-77
• 3.5.1 酶联免疫技术的改进-BA-ELISA74-75
• 3.5.2 两种暴露方式的比较75-77
• 第四章 免疫荧光法测大鼠体内的DBP77-91
• 4.1 实验材料77-78
• 4.1.1 实验动物77
• 4.1.2 实验仪器77
• 4.1.3 实验试剂77
• 4.1.4 实验溶剂77-78
• 4.2 实验方法78-80
• 4.2.1 DBP染毒液的配制78
• 4.2.2 DBP的暴露方法78
• 4.2.3 实验机理图78-79
• 4.2.4 实验步骤79-80
• 4.3 数据分析80-81
• 4.4 实验结果81-88
• 4.4.1 肝脏免疫荧光结果81-82
• 4.4.2 肾脏免疫荧光结果82-83
• 4.4.3 胃免疫荧光结果83-84
• 4.4.4 睾丸免疫荧光结果84-85
• 4.4.5 各器官的比较85-86
• 4.4.6 肝脏经24h、48h、72h处理后的荧光强度比较86-87
• 4.4.7 肾经24h、48h、72h处理后的荧光强度比较87-88
• 4.5 讨论88-91
• 4.5.1 DBP经大鼠皮肤暴露的可行性分析88-89
• 4.5.2 关于DBP含量的计算89
• 4.5.3 免疫荧光技术的意义89-90
• 4.5.4 皮肤涂抹的方式90-91
• 第五章 结论91-93
• 参考文献93-105
• 附录1 主要英文缩写词105-106
• 附录2 攻读学位期间发表的学术论文106-111
• 致谢111-112

【参考文献】

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