生物降解复合材料联合颌骨骨髓间充质干细胞促进不同类型骨缺损修复的实验研究

发布时间：2017-05-27 19:09

  本文关键词：生物降解复合材料联合颌骨骨髓间充质干细胞促进不同类型骨缺损修复的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牙周病是常见的口腔疾病,主要造成牙齿支持组织的破坏。目前牙周再生技术已被广泛用于促进牙支持组织的愈合。而再生技术的关键之一——植骨材料,通常用来治疗骨缺损。现在临床上主要的植骨材料包括自体骨、异体骨、异种骨和合成材料。自体骨是理想的植骨材料,但缺点是造成二次创伤、获取有限、易吸收等;异体骨具有良好的骨诱导和骨传导作用,但有免疫排斥和疾病传染的风险;异种骨Bio-Oss和合成材料壳聚糖是良好的生物活性支架材料,在人体内具有良好的生物相容性。近年来,壳聚糖由于其生物相容性好、可降解、具有抗炎作用等受到越来越多的关注。它被广泛用于支架材料、药物载体、伤口愈合等方面。Bio-Oss植骨材料是一种碳酸盐磷灰石结晶体,通过将牛骨特殊加工处理,去除其蛋白质和其他有机成分,并保持天然骨的无机结构,从而得到特别的骨引导支架,有助于新骨的形成,促进血管的再生和血凝块的稳定。目前天然高分子复合材料在骨组织工程中发挥着越来越重要的作用。下一代生物支架应当具备生物活性和生物降解特点,包括模拟自然骨的生理作用和激活体内组织再生过程。复合材料则是基于上述要求,将可降解高分子材料和生物活性支架结合于一身,比如将壳聚糖和Bio-Oss组合。壳聚糖的机械强度低于自然骨,不能承重和支撑外力,并且其自身不具有骨诱导作用,这就需要加入生物活性支架改善机械强度和骨诱导性。目前有很多材料加入壳聚糖中能改善其机械和生物特性,比如羟基磷灰石、β-三磷酸钙、硫酸钙、藻酸盐等。这样的复合材料具有特定的物理、生物、机械性能和可控制的降解性。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是骨组织工程中成熟的种子细胞,具有多向分化潜能。大部分已有研究的BMMSCs来自长骨或髂骨骨髓。由于其获取方便,体外扩增鉴定简单,被用来和多种生物材料复合共同促进再生。但目前很多研究表明,颌骨来源的骨髓间充质干细胞(jaw bone-derived BMMSCs,JBMMSCs)相对髂骨来源BMMSCs具有更强的生物学特性。将生物材料与干细胞复合后形成的新型材料是否就能达到理论上的先进性?实用临床效果如何?目前仍无定论;尤其是人体应用受到诸多条件和伦理所限,无法观察到是否形成了真正的组织学再生过程。所以本研究将通过体外材料和细胞学实验、体内结构形态学和定量组织学实验来系统观察和评估壳聚糖/Bio-Oss复合材料与人颌骨骨髓间充质干细胞(Human jaw bone marrow mesenchymal stem cells,h JBMMSCs)促进组织愈合的可行性以及前景。目的1、制备不同比例的壳聚糖/Bio-Oss复合材料并比较其理化性能;体外比较复合材料对hJBMMSCs粘附、增殖等生理特性的影响;2、观察壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合h JBMMSCs在大鼠颅骨缺损中的骨再生潜能;3、比较筛选一种合适的牙周骨缺损组织修复模型;4、将壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合hJBMMSCs植入所筛选的牙周骨缺损中评价其促牙周再生能力;5、为开发新型复合材料促进牙周和口腔组织再生提供理论和实验依据。方法1、壳聚糖/Bio-Oss复合材料理化性能检测按照壳聚糖和Bio-Oss粉的比例(100:0、75:25、50:50、25:75)将Bio-Oss粉加入壳聚糖/β-GP溶液中,冻干后用扫描电镜观察材料的孔径及孔隙率,测定材料的抗压强度、溶胀率、降解率。2、壳聚糖/Bio-Oss复合材料与hJBMMSCs体外共培养的生物学特性评价采用组织块法分离培养原代h JBMMSCs,有限稀释法纯化细胞;流式细胞仪检测细胞表面标记物;细胞克隆形成能力;成脂、成骨诱导检测细胞多向分化能力;CCK-8法检测细胞在材料上的增殖;扫描电镜观察细胞在材料表面的粘附;试剂盒检测材料对细胞碱性磷酸酶活性的影响。3、壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合h JBMMSCs修复大鼠颅骨缺损的实验研究将hJBMMSCs与壳聚糖/Bio-Oss复合材料共培养,植入8mm直径的SD大鼠极限颅骨缺损,8周后观察大体情况、Micro-CT检测缺损修复情况、HE染色和Masson's trichrome染色观察缺损愈合情况,免疫组化观察细胞植入后成骨细胞分化相关蛋白(骨钙素)表达情况。4、不同牙周骨缺损类型对引导组织再生术的组织修复能力的影响分别制备不同大小的1-,2-,3-壁牙周骨缺损和水平型III°根分叉骨缺损,植入Bio-Oss骨粉和Bio-Gide膜,8周后观察大体牙周愈合情况、Micro-CT检测骨缺损修复情况、HE染色和Masson trichrome观察牙周组织修复情况。筛选出适合评估牙周组织再生的骨缺损模型。5、壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合h JBMMSCs修复犬1壁牙周骨缺损的实验研究将h JBMMCs与壳聚糖/Bio-Oss复合材料共培养,植入1壁牙周骨缺损,8周后观察大体情况、Micro-CT检测骨缺损修复情况、HE染色和Masson trichrome观察骨缺损愈合情况、免疫组化观察细胞植入后成骨细胞分化相关蛋白(骨钙素)表达情况。结果1、单纯壳聚糖组(C组)的孔径、孔隙率、溶胀率和降解率均高于三组壳聚糖/Bio-Oss复合材料[C/B(75:25)、C/B(50:50)、C/B(25:75)],而C/B(75:25)组和C/B(50:50)组的孔隙率、溶胀率和降解率均高于C/B(25:75)组;同时C/B(75:25)组的降解率高于C/B(50:50)组;在抗压强度方面,三组壳聚糖/Bio-Oss抗压强度均高于C组,其中C/B(25:75)、C/B(50:50)组高于C/B(75:25)组。2、h JBMMSCs体外原代培养后,细胞贴壁培养,呈长梭形,并具有自我增殖和细胞克隆能力。细胞能阳性表达CD90、CD105、CD29、CD146、STRO-1等间充质来源干细胞标志,阴性表达CD34和CD45造血干细胞标志。成骨诱导可见钙化结节沉淀,成脂诱导可见脂滴形成。h JBMMSCs在三种材料(壳聚糖、壳聚糖/Bio-Oss、Bio-Oss)表面均能良好的粘附、生长,且三种材料对细胞的ALP活性影响无明显差异。3、第8周时,大体观察及Micro-CT示:比较新骨体积分数,实验组(C/B+cell、C+cell、B、C/B、C)高于对照组(p0.05),B组和C/B+cell组高于C+cell组、C/B组和C组(p0.05);组织学观察及定量分析示(p0.05):比较新骨面积,实验组(C/B+cell、C+cell、B、C/B、C)的新骨量高于对照组(p0.05),B组、C/B+cell组、C/B组、C+cell组高于C组(p0.05)。免疫组化显示,植入细胞组(C/B+cell、C+cell)新生骨周围及内部可见OCN阳性表达细胞,无细胞组(C、C/B、B、对照组)新生骨周围表达远远少于加细胞组。4、第8周时,大体观察及Micro-CT示:1-,2-,3-壁骨缺损和III°根分叉缺损实验组的新骨量均高于各组对应的对照组(p0.05);组织学观察及定量分析示:比较新骨高度和面积,1-,2-,3-壁骨缺损和III°根分叉骨缺损实验组均高于对应的对照组(p0.05);而对于结缔组织附着、结合上皮长度、新生牙骨质及新生牙周膜指标等,只有1壁骨缺损的实验组均优于各种对应的对照组(p0.05)。5、第8周时,大体观察及Micro-CT示:比较新生骨量,所有实验组(C、C+cell、C/B、C/B+cell、Bio-Oss)均高于对照组(p0.05),B组高于C组、C+cell组、C/B组(p0.05);组织学观察及定量分析示:比较新骨高度和新骨面积,C组、C+cell组、C/B+cell组、B组和C/B组高于对照组(p0.05),B组、C/B组和C/B+cell组高于C组(p0.05);新生牙周膜、新生牙骨质的指标中,C/B+cell组和B组高于C/B组、C+cell组、C组、对照组(p0.05);免疫组化显示:植入细胞组(C/B+cell、C+cell)新生骨周围及内部可见OCN阳性表达细胞,无细胞组(C、C/B、B、对照组)新生骨周围表达远远少于加细胞组。结论1、壳聚糖和Bio-Oss复合后能明显提高壳聚糖的抗压强度、降低其降解性能。壳聚糖和Bio-Oss质量比为50:50时,其孔径、抗压强度、溶胀率、降解率等方面性能较好。2、hJBMMSCs在壳聚糖/Bio-Oss复合材料上能良好的生长和增殖,壳聚糖/Bio-Oss复合材料对h JBMMSCs的ALP活性无明显影响,具有良好的生物相容性。3、牙周骨缺损模型中,1壁骨缺损与2壁、3壁骨缺损及水平III°根分叉骨缺损相比,虽然病损体积更大,组织修复的来源少,却在牙周再生的各项指标中具有更大的可比性,更适合作为评估牙周再生动物实验模型。4、壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合hJBMMSCs,部分hJBMMSCs分化为成骨细胞,与体内自身细胞共同促进了大鼠颅骨缺损、犬牙周1壁骨缺损的修复,并且与单纯壳聚糖和壳聚糖/Bio-Oss相比具有更强的促进成骨及促牙周组织再生能力。虽然在骨量方面没有超过单纯Bio-Oss材料,但从材料存留量以及生物学修复基础等多方面综合考量其应有更强的应用前景。
【关键词】：壳聚糖 骨髓间充质干细胞 Bio-Oss 颅骨缺损 牙周骨缺损
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.1
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文献回顾20-40
• 实验一 壳聚糖/Bio-Oss复合材料的制备和理化性质的测定40-48
• 1 材料40-41
• 2 方法41-43
• 3 结果43-45
• 4 讨论45-48
• 实验二 壳聚糖/Bio-Oss复合材料与h JBMMSCs体外共培养的生物学特性评价48-56
• 1 材料48-49
• 2 方法49-51
• 3 结果51-54
• 4 讨论54-56
• 实验三 壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合h JBMMSCs修复大鼠颅骨缺损的实验研究56-66
• 1 实验动物和试剂设备56
• 2 方法56-58
• 3 结果58-62
• 4 讨论62-66
• 实验四 不同牙周骨缺损类型对牙周再生能力的影响66-77
• 1 实验动物和试剂设备66
• 2 实验方法66-69
• 3 结果69-75
• 4 讨论75-77
• 实验五 壳聚糖/Bio-Oss复合材料联合h JBMMSCs修复犬1 壁牙周骨缺损的实验研究77-91
• 1 实验动物和试剂设备77
• 2 方法77-80
• 3 结果80-86
• 4 讨论86-91
• 小结91-92
• 参考文献92-109
• 个人简历和研究成果109-110
• 致谢110

【共引文献】

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6 戴l，

本文编号：400905