PI3Kγ在小鼠血管损伤中的作用及机制研究

发布时间：2017-05-31 12:16

  本文关键词：PI3Kγ在小鼠血管损伤中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：(1)血管损伤所致的血管疾患目前是全球范围内发病率及死亡率最高的疾病之一。近来研究发现PI3Kγ在炎症、氧化应激、心血管疾病及组织损伤、修复中起重要作用。本研究旨在探讨PI3Kγ在小鼠血管损伤中的作用及机制。(2)越来越多的证据表明血小板参与血管炎症的发生发展,本研究旨在探讨血小板PI3Kγ在血管损伤中的作用及机制。方法：(1)在小鼠颈动脉结扎模型基础上比较野生型(WT)及PI3Kγ基因敲除小鼠血管损伤反应。采用病理形态学分析新生内膜形成情况,并用免疫荧光及免疫组化法检测损伤血管炎症细胞浸润及NF-κB表达,RT-PCR检测炎症介质的表达, DHE染色检测血管壁活性氧生成。体外实验中采用MMT法及细胞划痕实验、transwell小室迁移法比较野生型PI3Kγ基因敲除血管平滑肌平滑肌细胞增殖及迁移。(2)在小鼠颈动脉部分结扎模型上反复静脉注射活化的血小板。采用病理形态学分析颈动脉中膜-内膜厚度,免疫荧光法检测血管炎症细胞浸润,明胶酶谱法检测受损血管局部MMP-9的活性,实时荧光定量PCR检测损伤血管局部炎症介质包括炎症因子(TNF-α、IL-6)及粘附分子(VCAM-1,ICAM-1)的表达,DHE染色检测血管壁活性氧生成。体外实验中采用流式细胞术检测血小板表面分子表达、活性氧生成、血小板白细胞聚集物形成,western blot检测血小板Akt及p-38表达及活化,血小板、内皮细胞共培养检测血小板-白细胞相互作用。结果：(1)血管损伤后3天、7天白细胞浸润明显,其中第3天以中性粒细胞为主,第七天以单核巨噬细胞为主,而PI3Kγ基因敲除小鼠损伤血管局部炎症细胞浸润均明显减少；PI3Kγ基因敲除小鼠损伤血管局部的细胞因子(TNF-α和IL-6)及粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)及NF-κB表达减少。(2)血管损伤后PI3Kγ基因敲除小鼠活性氧的生成较WT小鼠明显降低。(3)血管损伤后PI3Ky基因敲除小鼠新生内膜形成较WT小鼠明显减少,血管平滑肌细胞向内膜的增殖迁移减少；体外实验显示PI3Kγ-/-血管平滑肌增殖及迁移能力降低。(4)颈动脉部分结扎模型显示小鼠反复注射ADP活化的血小板后血管内膜-中膜增厚血管重塑明显,而注射PI3Ky-/-血小板后此作用明显减弱。(5)WT血小板注射小鼠损伤血管的炎症细胞浸润、炎症介质表达、MMP-9活性及活性氧生成明显增多；而PI3Kγ-/-血小板注射小鼠血管炎症细胞浸润、炎症介质表达、MMP-9活性及活性氧生成增多不明显。(6)体外实验研究发现ADP不能诱导PI3Ky-/-血小板Akt、p-38活化,不能诱导PI3Ky-/-血小板活化。(7)ADP不能诱导PI3Kγ-/-血小板NADPH酶活化及活性氧生成。(8)ADP诱导的血小板-白细胞聚集物形成及血小板-内皮细胞粘附中PI3Kγ-/-血小板较WT血小板明显减弱。结论：(1)PI3Kγ介导血管损伤后的炎症反应、活性氧生成及新生内膜的形成。(2)血小板PI3Kγ通过调节血小板活化、氧化应激及其与白细胞、内皮细胞的相互作用介导血管损伤后的炎症反应、活性氧生成及新生内膜形成。展望：PI3Ky可能作为心脑血管疾病的一个治疗靶点,同时血小板PI3Ky可作为心脑血管疾病中抗血小板治疗的一个新的研究方向。
【关键词】：PI3Kγ 血小板 血管损伤 炎症
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743;R543
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一部分 PI3Kγ在血管损伤修复中的作用及机制研究13-47
• 1 前言13-18
• 1.1 PI3Kγ的分子生物学特性13-15
• 1.2 PI3Kγ在炎症反应中的作用15-16
• 1.3 PI3Kγ与炎症性疾病16-18
• 2 材料18-19
• 2.1 仪器18-19
• 2.2 试剂及材料19
• 2.3 实验动物19
• 3 方法19-30
• 3.1 实验动物分组19-20
• 3.2 颈动脉损伤模型制作20
• 3.3 病理取材20
• 3.4 标本处理20-21
• 3.5 Verhoeff's染色(弹力纤维染色)21-22
• 3.6 组织形态学分析22
• 3.7 免疫荧光染色22-23
• 3.8 免疫组化染色23-24
• 3.9 定量PCR检测相关基因表达24-27
• 3.10 DHE染色27-28
• 3.11 平滑肌原代细胞培养28-29
• 3.12 平滑肌细胞增殖试验29
• 3.13 平滑肌细胞迁移趋化实验29-30
• 3.14 统计学分析30
• 4 结果30-43
• 4.1 PI3Kγ介导血管损伤后炎症反应30-36
• 4.2 PI3Kγ缺失抑制了血管损伤引起的活性氧生成的增加36
• 4.3 PI3Kγ介导血管损伤后平滑肌增殖及新生内膜形成36-43
• 5 讨论43-46
• 小结46-47
• 第二部分 血小板PI3Kγ在血管损伤修复中的作用及机制研究47-80
• 1 前言47-51
• 1.1 血小板是炎症的靶细胞47-48
• 1.2 血小板也可作为效应细胞促进炎症反应进程48-49
• 1.3 血小板在心血管疾病中的作用49-50
• 1.4 PI3Kγ在血小板中的作用50-51
• 2 材料51-53
• 2.1 主要仪器51
• 2.2 试剂及材料51-53
• 2.3 实验动物53
• 3 方法53-61
• 3.1 实验动物分组53
• 3.2 血小板分离、计数及体外活化53-54
• 3.3 颈动脉部分结扎术模型建立54-55
• 3.4 病理取材55
• 3.5 Verhoeff's染色(弹力纤维染色)55
• 3.6 免疫组化及免疫荧光染色55
• 3.7 DHE染色55
• 3.8 明胶酶谱法检测血管MMP-9活性55-57
• 3.9 RT-PCR57
• 3.10 流式细胞术57-58
• 3.11 Western blot58-60
• 3.12 免疫共沉淀60
• 3.13 内皮血小板粘附试验60-61
• 3.14 统计分析61
• 4 结果61-76
• 4.1 血小板PI3Kγ在血小板介导的颈动脉部分结扎术后内膜中膜增厚血管重塑中起着重要的作用61-63
• 4.2 血小板PI3Kγ在血小板介导的血管损伤后白细胞浸润中起着重要的作用63-64
• 4.3 血小板PI3Kγ在血小板介导的损伤血管局部炎症介质过表达过程中起着重要的作用64-65
• 4.4 血小板PI3Kγ介导活化血小板导致的损伤血管局部MMP-9活性增强65-66
• 4.5 血小板PI3Kγ在血管损伤后局部ROS的产生中起着重要作用66-67
• 4.6 血小板PI3Kγ介导ADP诱导的血小板激活67-68
• 4.7 血小板PI3Kγ通过Akt-以及p38 MAPK途径介导ADP诱导的血小板激活68-70
• 4.8 血小板PI3Kγ通过调节NADPH酶活性介导ADP诱导的血小板ROS的生成70-72
• 4.9 血小板PI3Kγ缺失后血小板-白细胞聚集明显减少72-74
• 4.10 血小板PI3Kγ缺失减少了血小板-内皮细胞的相互作用74-76
• 5 讨论76-79
• 小结79-80
• 结论80-81
• 展望81-82
• 综述 血小板在动脉粥样硬化中的炎性作用82-88
• 一、血小板是一种炎症细胞83-85
• 二、血小板与血管内膜的相互作用85
• 三、血小板与白细胞的相互作用85-86
• 四、血小板与内皮祖细胞的相互作用86-88
• 参考文献88-103
• 常用缩略词对照表103-106
• 致谢106-107
• 攻读博士学位期间的科研成果107

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本文编号：409460