Tudor-SN蛋白调控细胞内应激颗粒组装的分子机制

发布时间：2017-06-03 10:02

  本文关键词：Tudor-SN蛋白调控细胞内应激颗粒组装的分子机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:应激颗粒(Stress Granules,SGs)与加工体(Processing Bodies,PBs)是真核细胞受到氧化应激、热休克、紫外线照射及病毒感染等各种环境刺激时在胞浆中产生的与m RNA代谢密切相关的颗粒状结构。本课题组前期结果表明当He La细胞受到外界刺激,如0.5m M亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克时,Tudor-SN(Tudor Staphylococcal Nuclease)蛋白可以参与胞浆中SGs的组装,但深入的分子机制尚不完全清楚。本课题旨在进一步分析Tudor-SN蛋白的应激动力学属性及其在SGs组装动力学中的作用机制。方法:本课题实验分为三大部分,第一部分:①利用细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)、质粒转染-共聚焦显微镜分析Tudor-SN蛋白颗粒与SGs/PBs的共定位关系;②利用荧光漂白后恢复(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技术分析He La细胞中Tudor-SN蛋白颗粒的胞内应激动力学属性;③利用荧光漂白损失(Fluorescence loss in photobleaching,FLIP)技术分析Tudor-SN蛋白的核/浆穿梭属性及与SGs组装的相关性分析。第二部分:①利用AKTA纯化系统、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、质粒转染、GST融合蛋白钓取(GST-pulldown)技术进行SGs中包含Tudor-SN的蛋白应激复合物分析;②利用Oligo(d T)亲和层析、细胞荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP)等技术分析SGs中Tudor-SN蛋白与poly(A)+m RNA、AGTR1-3'UTR的结合及共定位关系。第三部分:①利用GFP-sh RNA干扰和荧光漂白后恢复(FRAP)技术分析He La细胞中Tudor-SN对于SGs/PBs蛋白组装动力学的影响;②以Tudor-SN基因敲除(Tudor-SN-/-)小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)为实验对象,分析Tudor-SN对于poly(A)+m RNA应激颗粒形成的影响;③利用si RNA干扰和多聚核糖体解聚曲线分析研究Tudor-SN蛋白与多聚核糖体应激解聚的相关性;④以AGTR1-3'UTR(3'-untranslated region of angiotensin II receptor,type 1 m RNA)为具体靶基因,利用GFP-MS2系统实现AGTR1-3'UTR的活细胞内动态标记,并结合si RNA干扰、ds Red-sh RNA干扰、荧光漂白后恢复(FRAP)、细胞免疫荧光、活细胞工作站等技术分析Tudor-SN蛋白对AGTR1-3'UTR应激动力学行为的调控作用。结果:第一部分:①He La细胞内源性Tudor-SN蛋白与SGs标记蛋白(Hu R、PABP1、G3BP)存在颗粒共定位关系,与SGs/PBs共同蛋白(AGO1/2)部分共定位,但与PBs标记蛋白(DCP1a、GW182)并无共定位关系;外源性RFP-Tudor-SN融合蛋白与GFP-AGO2蛋白存在一定的颗粒共定位关系,但不与GFP-DCP1a/b、GFP-DCP2、GFP-GW182以及GFP蛋白共定位。②给予细胞高强度激光漂白后,兴趣区Tudor-SN蛋白颗粒的荧光强度降低到原来的~23%,随后荧光信息恢复至漂白前荧光强度的~66.3%,光漂白后恢复速率t1/2值为9.22±1.72sec。③给予细胞脉冲式重复光漂白后,兴趣区Tudor-SN蛋白颗粒荧光信号完全消失,伴随同一细胞内邻近检测区Tudor-SN蛋白颗粒和细胞胞核内Tudor-SN蛋白荧光信号的逐渐降低。第二部分:①Tudor-SN蛋白可以与TIAR、AGO1/2、PABP1、e IF5A、Hu R、TTP等蛋白形成应激复合物,但不包含DCP1a蛋白,另外,Tudor-SN蛋白的SN1结构域是介导其与PABP1、TIAR、AGO1/2蛋白结合作用的主要功能片段。②Tudor-SN可通过RNA的桥联作用与PABP1蛋白结合,还可与poly(A)+m RNA、AGTR1-3'UTR结合并共同定位于SGs结构中。第三部分:①与对照组相比,当下调He La细胞内Tudor-SN蛋白表达时,SGs颗粒兴趣区光漂白后恢复速率t1/2值由4.35±1.26sec升至7.01±1.55sec(P0.05),而PBs颗粒兴趣区t1/2值差异无统计学意义。②Tudor-SN基因敲除不能完全阻止但可有效抑制poly(A)+m RNA应激颗粒的形成。③应激状态下,以放线菌酮或嘌呤霉素干扰多聚核糖体解聚过程可以影响Tudor-SN应激颗粒的胞浆组装,而以si RNA干扰技术下调细胞内Tudor-SN的表达,并未观察到多聚核糖体应激解聚过程的改变。④利用GFP-MS2系统构建p T7-AGTR1-3'UTR-24×MS2重组真核质粒,在活细胞内成功实现对于AGTR1-3'UTR的GFP标记,后者与Tudor-SN蛋白呈现相同的颗粒组装过程。当下调细胞内Tudor-SN蛋白表达时,AGTR1-3'UTR颗粒组装过程受到影响。给予细胞高强度激光漂白处理,AGTR1-3'UTR颗粒兴趣区光漂白后恢复速率t1/2值由9.96±0.78sec升至16.77±1.94sec(P0.05)。结论:1)Tudor-SN蛋白是一种SGs特异性蛋白,具有核浆穿梭特性,后者参与Tudor-SN蛋白颗粒呈现高度动态性的组装过程。2)Tudor-SN与PABP1、TIAR等多种应激蛋白以及poly(A)+m RNA相互作用,形成应激蛋白-核酸复合物,共同参与细胞胞浆SGs结构的形成。3)Tudor-SN蛋白对于多聚核糖体的应激解聚过程并无影响,但可调控SGs蛋白-核酸成分(如G3BP蛋白、AGTR1-3'UTR)的应激组装动力学行为。
【关键词】：Tudor-SN 应激颗粒 加工体 poly(A)+mRNA AGTR1-3'UTR
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语12-16
• 前言16-22
• 研究现状、成果16-19
• 研究目的、方法19-22
• 一、Tudor-SN蛋白的应激动力学属性分析22-41
• 1.1 对象和方法22-31
• 1.1.1 细胞和质粒22
• 1.1.2 主要试剂22-23
• 1.1.3 主要溶液、缓冲液和培养基23-24
• 1.1.4 主要仪器、设备24-25
• 1.1.5 实验方法及流程25-31
• 1.2 结果31-38
• 1.2.1 Tudor-SN蛋白颗粒与SGs/PBs的共定位分析31-34
• 1.2.2 Tudor-SN蛋白颗粒的组装动力学分析34-35
• 1.2.3 Tudor-SN蛋白的核/浆穿梭及与SGs组装的相关性分析35-38
• 1.3 讨论38-40
• 1.4 小结40-41
• 二、包含Tudor-SN的蛋白-核酸应激复合物分析41-61
• 2.1 对象和方法41-53
• 2.1.1 细胞与质粒41
• 2.1.2 主要试剂41-43
• 2.1.3 主要溶液、缓冲液和培养基43-46
• 2.1.4 仪器设备46
• 2.1.5 实验方法及流程46-53
• 2.2 结果53-58
• 2.2.1 Tudor-SN应激蛋白-蛋白复合物分析53-55
• 2.2.2 Tudor-SN应激蛋白-核酸复合物分析55-58
• 2.3 讨论58-60
• 2.4 小结60-61
• 三、Tudor-SN对于SGs应激组装动力学的调控61-85
• 3.1 对象和方法61-71
• 3.1.1 细胞和质粒61-62
• 3.1.2 主要试剂62-63
• 3.1.3 主要溶液、缓冲液和培养基63
• 3.1.4 仪器设备63
• 3.1.5 实验方法及流程63-71
• 3.2 结果71-82
• 3.2.1 Tudor-SN对于SGs/PBs蛋白组装动力学的影响71-72
• 3.2.2 Tudor-SN基因敲除对于poly(A)+ mRNA应激颗粒形成的影响72-73
• 3.2.3 Tudor-SN蛋白与多聚核糖体应激解聚的相关性分析73-74
• 3.2.4 Tudor-SN蛋白调控AGTR1-3'UTR的应激动力学行为74-82
• 3.3 讨论82-84
• 3.4 小结84-85
• 全文结论85-88
• 论文创新点88-89
• 参考文献89-102
• 发表论文和参加科研情况说明102-105
• 综述 细胞内RNA标记技术的研究进展105-125
• 综述参考文献115-125
• 致谢125

【共引文献】

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本文编号：417833