SRY在动脉粥样硬化和Tirofiban在肾缺血再灌注中的作用机制研究

发布时间：2017-06-04 05:12

  本文关键词：SRY在动脉粥样硬化和Tirofiban在肾缺血再灌注中的作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞外微泡(extracellular vesicles,EVs)是一类体积较小的膜囊泡。,是从细胞膜表面脱落产生的囊泡,具有双层脂质分子结构,其结构包括细胞膜,胞浆和部分蛋白质和遗传物质。EVs包括外泌体(exosomes)和脱落囊泡两类,前者为细胞胞吐作用产生的多胞体,后者由细胞出芽生殖产生。既往的研究认为EVs是不具有功能的细胞尘埃,但是大量近期研究表明,它是一种重要的细胞交流载体,具有重要的生物学功能。本实验室的前期研究表明,微泡中存在的DNA可以通过胞吞作用或膜融合从一个细胞进入另一个细胞。利用微泡转运的DNA进入新的细胞之后可以融合进入接受细胞的基因组,编码相应的mRNA和蛋白质。但是,微泡DNA在疾病中发挥的病理作用尚不完全清楚。现有的研究发现微泡在肿瘤发生中发挥了重要的作用,参与了肿瘤细胞的浸润和远处播散。肿瘤细胞来源的微泡可以使正常细胞表现出癌变的表型。除肿瘤以外,微泡也参与多种疾病的发病过程。越来越多的证据显示,通过细胞间通讯,微泡调节血小板的黏附性以及白细胞和内皮的相互连接,参与了动脉粥样硬化的病理过程。但是否微泡中DNA参与了这一过程,尚不清楚。另一方面,Y染色体,除了是保证男性特征的重要因素以外,在心血管疾病中发病的作用也越来越引起研究者的重视。一些研究发现Y染色体上的一重要基因SRY(sex determining region,Y;即Y染色体性别决定域)对增加血管紧张素Ⅱ和去甲肾上腺素水平具有调节作用。而男性多体性的Y染色体(大部分为XYY核型)可显著的增加冠心病的发病风险。而微泡中是否含有SRY基因DNA,该DNA是否参与了动脉粥样硬化的病理过程,尚不清楚。因此,本研究拟以人群研究、实验动物分析及细胞实验为研究方法,分析血中游离微泡所含SRY DNA对白细胞和内皮细胞相互作用的影响及其在动脉粥样硬化病理过程中的作用机制。1.1研究方法1.1.1分析男性冠心病患者srydna基因拷贝数(genecopynumber,gcn)的变化情况本部分实验以正常男性及男性冠心病患者的血液样本为研究对象,利用pcr、dna测序技术、实时定量pcr和免疫印迹法等技术手段,分析srydna基因拷贝数的在不同人群的改变情况。1.1.2研究微泡中srydna的转移性及功能本部分实验构建sry-hek293细胞株,分析sry-hek293来源的微泡对单核细胞黏附蛋白cd11-a及内皮细胞黏附蛋白icam-1表达的作用,sry蛋白对cd11-a及icam-1基因启动子的调控作用,sry微泡对单核细胞/内皮细胞粘附的作用。1.1.3研究微泡中srydna对apoe敲除小鼠动脉粥样硬化发生的作用。本部分实验将利用apoe敲除小鼠,分析sry微泡对小鼠动脉粥样硬化的影响,以及对小鼠单核细胞和内皮细胞粘附蛋白cd11-a及icam-1表达的影响。1.2研究结果1.2.1在该部分实验中,我们首先证实了男性血浆微泡中存在srydna,且男性冠心病人血浆微泡中sry基因拷贝数显著的高于正常男性。而男性冠心病患者白细胞sry的基因拷贝数、mrna表达及蛋白表达同样均显著的高于来源于正常男性的白细胞(p0.05)。进一步的研究发现,男性冠心病患者白细胞上黏附因子cd11-a的蛋白表达显著的高于对照人群(p0.05)。1.2.2为分析微泡中srydna的功能,本实验首先构建了表达sry基因的hek293细胞并对该细胞系微泡中的srydna进行鉴定。结果显示,sry-hek293细胞分泌微泡中存在srydna及蛋白的表达。sry微泡可显著的增高单核细胞粘附因子cd11-a及内皮细胞粘附因子icam-1的蛋白表达(p0.05)。sry蛋白与cd11-a及icam-1启动子均有结合,提示sry对cd11-a及icam-1的调节作用存在于转录水平,并进一步增加了thp-1细胞与huvecs细胞的粘附作用(p0.05)。1.2.3进一步的实验在动物水平验证之前的结构。利用血管组织的油红o染色及组织h/e染色,对斑块形成情况进行观察,结果发现:使用sry微泡注射可显著增大动脉粥样斑块的面积,加重血管壁上的脂质沉积。而elisa实验也发现,sry微泡显著的增高了ApoE敲除小鼠单核细胞CD11-a及血管ICAM-I的蛋白表达。(P0.05)1.3结论1.3.1男性血浆微泡中存在SRY DNA,且男性冠心病人血浆微泡及白细胞中SRY基因表达及功能均显著高于正常男性。1.3.2 SRY微泡通过调节粘附因子CD11-a及ICAM-1调节了单核细胞与内皮细胞间的粘附作用。1.3.3 SRY微泡通过调节单核细胞与内皮细胞间的粘附作用参与了血管动脉粥样硬化的发病。研究背景:肾缺血再灌注损伤是临床上常见的多途径发挥作用、多分子参与多因素造成的复杂病理生理过程。且其发挥作用的各种因素并非孤立存在,其各种因素相互关联相互影响,也是肾脏的结构与功能由正常到损伤,直至不可逆性造成器官衰竭和功能损伤的关键。肾脏为高灌注器官,大概占心排出容量的20%,当肾脏出现血液灌流量不足,通过输液、补液等恢复肾脏缺血组织和器官的方式,使肾脏重新恢复血流得到血氧的供应后,不仅能够直接诱导肾脏实质器官的炎症反应从而影响到局部缺血组织的存活以及功能,并且可以造成全身炎症性的反应,累及心脏、肝肺组织、肾脏、小肠、甚至脑等远隔器官、从而导致进一步的组织损伤以及严重的功能障碍[1]。临床上,在低血容量性创伤性休克或者一些能够暂时阻断肾脏血流供应的外科手术中,肾脏血流灌注恢复后同样有可能引起肾脏IRI。严重的IRI可导致急性肾功能衰竭(ARF)[2-3],其死亡率大于50%。肾脏IRI更是影响肾脏短期和长期生存的主要非抗原依赖因素,造成的严重程度和继发性损伤都可以影响到移植肾脏的存活率及后续生理功能。怎样减轻和防止肾脏IRI,一直以来都是肾脏保护中的重要课题,日益成为临床和科研关注的热点。替罗非班(Tirofiban)是一种新型可逆性非肽类血小板表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂,是非肽酪氨酸衍生物,为整合素家族中的一种小型分子,可抑制纤维蛋白原与血小板糖蛋白Ⅱb/ma受体的结合,从而抑制血小板聚集以及血栓的形成[4]。具有比较短的抗血小板半衰期以及较长的血浆半衰期。GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂阻断了血小板聚集的最终通路,可以减少血小板依赖性循环血流减少的作用时间,并没有发现任何并发症,被认为是最有效地抗血小板药物之一。Tirofiban具有抗炎、抗细胞凋亡、抗细胞增殖及抗氧化的作用[5-6]。但Tirofiban是否对缺血再灌注损伤肾脏具有保护作用,目前并没有此类报道。因此,本次实验研究中采取蛋白免疫印迹法(western blot),TUNEL检测调亡细胞和ELISA等实验技术,观察肾缺血再灌注损伤后大鼠血清尿素氮浓度,血清肌酐浓度,肾组织中bax和bcl-2的表达以及Bax/Bcl-2的比值比,肾缺血再灌注组织中凋亡细胞的检测,来探讨Tirofiban对大鼠肾缺血再灌注造成损伤的保护作用和相对的机制,为临床防治肾功能损伤和预防提供可靠地理论依据。研究目的:研究Tirofiban对大鼠肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reper fusion injury,RIRI)的影响,然后从肾脏组织功能、肾组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、肾组织超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性、缺血再灌注后肾脏组织病理改变等方面探讨Tirofiban肾脏保护作用的作用以及机制。研究方法:随机选取20只雄性SD大鼠,体重平均为250 260g,随机性分为四组:假手术组(control)、假手术+Tirofiban干预组(T组)、肾缺血再灌注组(IR组)和肾缺血再灌注+Tirofiban干预组(IR+T组),每组5只。切除其右侧肾脏组织,无创性动脉夹夹闭大鼠左侧肾动脉45min后,去掉无创动脉夹恢复肾脏组织血流供应的方法建立大鼠肾缺血再灌注24h模型。control组:打开腹腔,分离肾蒂周围组织,但不夹闭双侧肾蒂;T组:假手术组给予Tirofiban(剂量为200μg/kg)IR组夹闭右肾动静脉45min,给予再灌注,缝合24h后取材进行实验。IR+T组:肾脏缺血即夹闭左侧肾蒂前15min给予同等剂量Tirofiban。造模成功24h后收集各处理组血清及肾组织标本,检测各组大鼠肌酐SCR、LDH、MDA、SOD、肾组织中bax和bcl-2表达及Bax/Bcl-2比值比,肾组织中凋亡细胞的检测等含量的指标变化,行HE染色观察光镜下肾组织病理学结果,电镜检测肾缺血再灌注损伤以后肾脏结构的变化。研究结果:1.Tirofiban能改善肾缺血再灌注损伤导致的肾功能衰竭首先,我们建立SD大鼠肾缺血再灌注损伤模型,观察Tirofiban对肾缺血再灌注造成肾脏功能损伤的相对应保护及其作用机制。肾缺血再灌注损伤导致SD大鼠血AST、尿素氮和血肌酐水平明显升高,肾功能严重受损,同时肾组织病理切片(HE染色)可见肾小管上皮细胞损伤明显,空泡样变性、坏死,管腔扩张,肾小管和肾组织中有较多的血管充血和出血点,红细胞聚集以及明显坏死性沉淀,可看到肾小球变性,肾脏间质出现严重水肿,肿胀坏死变性明显形成,管腔内内出现管型嗜酸性粒细胞。给予Tirofiban预保护后,血AST、尿素氮和血肌酐水平显著下降,并且病理学评分降低,病理切片提示只有少量细胞坏死,肾小管损伤程度明显减轻,炎性细胞浸润不明显,单纯性肾间质水肿和充血为主。通过血清学指标和组织病理学评分初步证实Tirofiban对肾缺血再灌注损伤具有保护作用。2.Tirofiban能减少肾缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡为进一步分析肾组织中细胞凋亡水平变化,我们采用了TUNEL染色和凋亡蛋白免疫印迹的方法。TUNEL染色提示control组仅见极少数散在的凋亡细胞;IR组TUNEL阳性细胞数量显著,外髓区远曲小管分布较多,其余少量分布于皮质肾小管,也可见部分脱落进入到肾小管内;IR+T组可见少量的TUNEL阳性细胞。同时,与control组相比,IR后凋亡蛋白caspase-3和Bax蛋白水平增加,Bcl-2水平则降低,给予Tirofiban干预后相比,caspase-3和Bax蛋白水平显著下降,Bcl-2水平则升高,再次证实肾缺血再灌注损伤后Tirofiban可减少细胞凋亡。3.Tirofiban能减轻肾缺血再灌注损伤导致的氧化应激反应为了揭示Tirofiban对肾IRI的保护机制,我们检测了SD大鼠体内氧化应激水平,进行血清SOD、GSH、MDA、MPO和炎性因子(IL-1β和TNF-β)检测。与IR组相比,IR+T组可显著降低缺血再灌注大鼠血清MDA、MPO和炎性因子(IL-1β和TNF-β)水平,同时可显著提高SOD和GSH水平,降低MDA、MPO和IL-1β、TNF-β水平,提示Tirofiban可能通过氧化应激环节发挥其保护作用。4.Tirofiban通过对NO途径发挥对肾缺血再灌注损伤的保护作用我们分析了一氧化氮合酶和氧化应激关系,既往研究提示肾脏氧化应激水平与一氧化氮合酶有密切关系。为了明确NO是否在Tirofiban对肾缺血再灌注损伤保护作用中发挥关键作用,检测了内皮型一氧化氮合酶(e NOS)和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)水平,在IR组和IR+T组,两者的变化趋势相反。为了明确e NOS和i NOS的作用,采用肾脏内皮细胞(NRK52E细胞株)建立缺氧复氧细胞模型,分别加入e NOS和i NOS的抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)和甲基异硫脲(SMT),L-NAME可明显阻断Tirofiban对肾脏内皮细胞的保护作用。这一结果证实在肾脏缺血再灌注损伤过程中,Tirifiban通过对e NOS的调控发挥其对肾脏的保护作用。结论:1.Tirofiban能够改善肾脏缺血再灌注所致的肾脏损伤,有助于肾脏功能恢复。2.Tirofiban对缺血再灌注后的肾组织具有显著的抗损伤、抗凋亡和抗氧化作用。3.Tirofiban对肾缺血再灌注损伤的保护作用是通过NO信号通路来完成。4.在各实验组检测到的不同数据,为肾脏缺血再灌注损伤及Tirofiban预处理后特异性的表达,进一步研究数据差异,深入了解Tirofiban保护肾脏缺血再灌注损伤的功能及其内在机制。
【关键词】：微泡 SRY 基因拷贝数 ICAM-1 CD11-a 动脉粥样硬化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5;R692
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 第一部分6-43
• ABSTRACT6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 细胞外微泡中SRY基因在动脉粥样硬化中的作用及机制14-40
• 2.1 材料与方法14-31
• 2.2 结果31-37
• 2.3 讨论37-40
• 参考文献40-43
• 第二部分43-84
• Abstract43-47
• 中文摘要47-50
• 前言50-51
• 材料与方法51-68
• 实验结果68-76
• 讨论76-80
• 结论80-81
• 参考文献81-84
• 文献综述 细胞外囊泡在动脉粥样硬化发病中的机制研究进展84-97
• 参考文献91-97
• 攻读博士学位期间发表文章情况97-98
• 致谢98-99

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本文编号：420086