腺苷缓释生物敷料在糖尿病溃疡中的作用研究

发布时间：2017-06-04 19:10

  本文关键词：腺苷缓释生物敷料在糖尿病溃疡中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：国际糖尿病联盟(IDF)的评估报告显示,2013年全世界共有约3.82亿糖尿病患者,同时约3.16亿人糖耐量受损,成为糖尿病的极高危人群。从2000年开始,国际糖尿病联盟就一直在关注糖尿病在全世界的发展及变化。过去,人们一直认为糖尿病一种“富贵病”,这种错觉多半与肥胖人群的高发病率因素相关,然而研究人员调查的数据显示,全世界80%的糖尿病患者集中在中等收入和低收入的国家。中国目前共有糖尿病患者9200万人,已经超越印度,成为了全世界糖尿病人口最多的国家。同时糖尿病在儿童和青年人群中的发病率也有不断升高趋势,这值得引起全世界的关注。糖尿病患者一生中发生糖尿病足的概率高达25%,而在每年因为非创伤造成的截肢人群中,糖尿病患者约占85%以上。全球每30s就有一个病人的下肢因糖尿病而被截除。不仅如此,这些接受截肢手术后的患者,除了面对行动不便、疼痛等诸多问题外,其5年生存率仅为31%。有研究称,仅在糖尿病被诊断的最初2年,糖尿病足的治疗费用就高达30724美元。因此在应对糖尿病问题上,必须联合全世界的共同努力,只有在这个基础上采取有效的手段,才能赢得人类未来的健康和幸福。糖尿病足发生的一个主要病因是外周血管病变。糖尿病患者出现的组织灌注减少和微血管发生病变,对外周神经病变的发生同样起了重要的负面作用。正常伤口的愈合是由多种细胞共同参与的一个过程。高血糖可以同时对参与修复的干细胞、白细胞、成纤维细胞、内皮与平滑肌细胞等产生干扰作用,而组织缺血使伤口环境更加恶化,最终结果表现为溃疡不愈合。干细胞被认为是影响组织修复的关键因素,其正常状态下主要以休眠状态存在于成年人的骨髓中,当组织受到损伤时,干细胞如间充质干细胞(MSCs)可以向伤口周围迁移,通过旁分泌机制和向ECs分化的途径促进血管再生,从而加速伤口愈合。然而在溃疡周围恶劣的环境下,移植干细胞的生存状况差,一直是干细胞治疗面临的一个难题。因此,解决糖尿病溃疡移植干细胞存活率低的问题,将极大地改善其治疗效果。腺苷(ADO)作为细胞的一种代谢分子,经研究证实可以通过直接或者间接作用于血管内皮细胞调节血供的平衡,在血管再生过程中发挥十分重要的作用。而ADO对缺血心肌的保护作用也引起很多关注。同时研究发现与再生和修复过程必不可少的免疫系统,同样与ado密不可分。ado可以直接作用于免疫细胞,调节vegf,il-6,il-8,bfgf等与血管再生至关重要的生长因子的分泌。本研究认为,在恶劣的伤口环境下,如果ado能够促进干细胞的存活或者增强干细胞的部分功能,将可以进一步改善对溃疡的治疗效果。虽然已经有诸多证据,但是本研究仍然对ado在体内和体外能否发挥保护移植干细胞的作用存在疑问。新型敷料的出现,在促进伤口愈合的多个方面给与了更多的支持,同时与干细胞联合使用可以在移植初期对干细胞的生存环境进行一定的改善。本研究通过电纺丝的方法合成的新型敷料具有良好的生物活性。而壳聚糖、纤维蛋白等新型缓释生物材料的出现,使对药物释放有了更多的控制。考虑到腺苷在体内极短的半衰期,本研究进一步提出了问题,如果ado能在糖尿病溃疡的治疗上发挥有利作用,设计ado缓释的新型材料是这一问题的先决条件。要解开上述提到的三个问题,必须一步步的用实验进行验证。接下来本研究将分为三个章节来对上述问题进行更加深入的研究。一、ado对间充质干细胞在高糖条件下保护作用的研究间充质干细胞由于其多项分化潜能和强大的旁分泌作用,在组织修复的多个领域发挥了重要作用,而被认为是干细胞治疗糖尿病溃疡的最佳选择。目前研究表明,糖尿病患者体内包括间充质干细胞在内的多种干细胞的数量及增殖能力均有不同程度受损,因此持续性高血糖是导致干细胞功能受损的主要因素。同时,也有研究显示hmscs细胞表面表达腺苷的受体,并且其细胞的分化受到腺苷的影响。在体外实验中,将葡萄糖的高糖(hg)浓度设定在30mol/l,低糖(ctrl)对照组设定为5.5mol/l,同时根据前期研究将ado的作用浓度设定为100mmol/l。将在低糖条件下正常生长的第5-8代hmscs中加入高糖培养基以此作为对照组,并将100mmol/lado作为刺激源加入高糖培养基中作为实验组。通过对比cck-8、transwell和elisa实验,来对高糖条件下的msc的增殖、迁移及旁分泌作用进行测定。结果发现,在短时间的高糖条件下,hmscs的增殖与迁移能力并没有明显受损,同时研究发现ado对hmscs的增殖并没有产生显著影响,而在没有外来趋化因子作用下,hmscs的迁移能力也并没有受到ado的改变。但是我们意外的发现,ado刺激明显增加了hmscs多种生物活性物质的分泌,vegf、bfgf和il-8的表达明显上调。这个结果说明ado虽然对细胞增殖与迁移没有直接性影响,但是对细胞功能的改善作用是突出的。这也暗示其对细胞的功能的改善将有可能直接影响其治疗糖尿病溃疡的效果。通过对hmscs表面不同的ado受体进行选择性的阻断和对应诱导剂的使用,让我们进一步发现了ado对hmscs作用的发生与其表面受体的对应关系,这将对今后ado及其作用机制的深入研究奠定基础。二、腺苷缓释生物材料的设计糖尿病溃疡作为一种慢性开放性创伤,其治疗和护理必然要用到的医用敷料这一重要医疗用品。传统敷料虽然可以应对大多数伤口护理的需要。但是在糖尿病溃疡治疗汇总暴露出来的一些不足例如:不能保持伤口的湿润环境,浸湿后致病微生物容易通过和纤维脱落造成异物反应等,这些都可能延缓伤口的愈合。这在糖尿病溃疡的治疗中显然不能够满足本身已经难以愈合的伤口治疗需求。因此,开发对糖尿病溃疡的特点更加具有针对性的新型敷料的愿望变得尤为迫切。同时调查还显示随着移植需求的扩大,以及移植技术和再生医学的进一步发展,联合支架、药物、细胞和生长因子的新型生物疗法将成为未来再生医学的发展方向。研究人员通过对糖尿病溃疡的研究,在新型生物敷料的开发上提出了更高的要求。理想的新型生物敷料应该满足以下条件:维持伤口周围的湿润环境、抗菌(能够保护溃疡免受二次感染的危险)、清除坏死组织及分泌物和促进溃疡区域的组织再生。虽然现有的敷料都难以在所有的方面满足上述条件,但是新型生物敷料已经在朝着这个目标不断进步,相比于传统敷料已经具有了很大的优势。目前已经有生物聚合材料在实验研究中证实了其促进组织愈合的治疗效果。同时已经有部分生物材料进入了商品化阶段。为了满足新型敷料的多元化要求,联合应用支架、药物、细胞的生物敷料无疑是一个绝佳的选择。在众多已经证实据有控释作用的材料中,在研究中我们尝试了壳聚糖包埋和壳聚糖联合pla聚合物的电纺丝技术等,将ado进行物理包埋。壳聚糖是天然存在的生物多糖,其本身具有良好的生物相容性、无毒、无免疫原性的优势。壳聚糖能够包埋亲水性的药物,是一种良好的载体。通过高分辨率液相色谱对腺苷的缓释效果进行检测,结果显示单纯壳聚糖包埋的ado能够延缓释放,但是缓释效果并不理想,在体外缓释试验中2小时的释放率约80%,可以说其控制释放的效果较差。但是壳聚糖包埋及联合应用电纺丝技术都明显延长了对ado的控释效果。结果证明,pla聚合物不仅可以将将其制备为具有良好的组织相容性的敷料,同时可以使该新型敷料具有缓释ado的效果。三、搭载间充质干细胞的腺苷缓释生物敷料在糖尿病溃疡中的作用缓释生物材料的研发使药物的在体内释放的可控性大大增加。而以此为基础的联合多种药物的缓释技术仍然困难重重。研究人员在针对不同的药物的固有特定与缓释要求的缓释上不得不设计更多的载体来满足药物组合的个性化需求,这无疑是极为困难的。虽然已经有外用vegf、egf等生长因子以及联合使用抗生素药物等促进溃疡愈合的作用研究,并取得了良好的实验结果,但是单一应用一种生长因子从治疗效果来说仍然是十分有限的。怎样才能使糖尿病溃疡获得更好的治疗效果,我们不得不考虑如何在现有条件下解决上述难题。事实上我们已经知道了间充质干细胞本身具有强大的旁分泌作用,其分泌的vegf、bfgf、tgf-β等一系列生物活性物质在促进组织修复过程中都是极为重要的。同时间充质干细胞还能够调控免疫细胞的功能,改善伤口区域的恶劣环境,将炎症反应阶段转化为修复阶段,这将为后期的组织修复创造良好的条件。与此同时药物与生长因子将可以更好地发挥作用,这将会对糖尿病溃疡以及多种组织损伤的恢复带来新的福音。通过将ado缓释的新型电纺丝材料作为载体进行灭菌处理,将生长状态良好的带有绿色荧光的第5-8代hmscs-g种植在材料的表面。在5%co2、37℃的细胞培养箱中孵育6小时。通过激光共聚焦显微镜观察细胞的贴壁及生长情况,结果发现该生物材料具有良好的细胞亲和性,hmscs-g在无论是有没有缓释ado的生物材料上均表现出良好的贴壁生长状态。我们提取了种植有间充质干细胞的ado缓释生物材料的条件培养基,并在体外实验中将其加入到ecs与fcs的培养基,检测结果显示,对比与没有ado的缓释材料,ado缓释刺激下的hmscs表现增强的促进ecs和fcs的增殖与迁移的效果。并且该效果在短时间内并没有受到高糖作用的影响。为了进一步证实搭载间充质干细胞的ado缓释生物敷料的治疗效果,本研究中以c57小鼠为对象,通过腹腔注射stz溶液的方法诱导了小鼠的糖尿病模型。并通过显微手术结扎了小鼠的股动脉远端,并在小鼠下肢的外侧切除了5×5mm的全层皮肤组织,以此来完成缺血性糖尿病溃疡的动物模型。将表面种植了hmscs-g的生物材料覆盖在溃疡的伤口区域,并进行包扎固定。观察糖尿病溃疡的愈合速度发现,ado缓释组的愈合速度明显高于不含ado的实验组。组织学观察也进一步确认,ado缓释组小鼠溃疡区域表现出更高的血管密度。动物实验充分证实了搭载干细胞的ado缓释生物敷料对糖尿病溃疡的治疗效果。综上所述,通过本文上述的三个部分的研究,首先,在体外实验中证实,ADO能够通过不同的受体增强间充质干细胞的旁分泌作用。其次,为了能够发挥ADO在体内的持续刺激作用,本研究通过联合应用壳聚糖包埋以及PLA聚合物的电纺丝技术的等手段,制备出了具有良好组织相容性的生物敷料,同时解决了ADO的缓释问题。在最后一部分中,本研究将上述两者结合起来,并以糖尿病溃疡小鼠为对象,模拟在高血糖等不利因素的作用下,搭载间充质干细胞的ADO缓释生物敷料的在体疗效。结果显示联合细胞、药物、支架的新型生物敷料通过改善伤口区域的血液供应,实现了明显加快溃疡愈合的预期结果。相信在不久的将来,新型生物材料的多方面联合应用,将会对糖尿病溃疡、肝损伤、心肌损伤等多个领域提供更加有效地治疗,而本文也为现阶段所面临的治疗难题的临床可用疗法的提出奠定了基础。
【关键词】：腺苷 人来源间充质干细胞 糖尿病溃疡 缓释 血管再生
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-11
• 中文摘要11-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 腺苷对间充质干细胞功能的调节作用19-34
• 2.1 材料与方法19-27
• 2.2 结果27-31
• 2.3 讨论31-33
• 2.4 小结33-34
• 第三章 缓释腺苷的新型生物敷料的构建34-43
• 3.1 材料与方法35-38
• 3.2 结果38-41
• 3.3 讨论41-42
• 3.4 小结42-43
• 第四章 搭载干细胞的腺苷缓释生物敷料对糖尿病溃疡的治疗效果及作用机制43-60
• 4.1 材料与试剂43-50
• 4.2 结果50-57
• 4.3 讨论57-59
• 4.4 小结59-60
• 全文结论60-62
• 参考文献62-67
• 文献综述 糖尿病溃疡新型生物疗法的研究进展67-93
• 参考文献82-93
• 攻读博士期间的研究成果93-94
• 致谢94

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;Repair effect of diabetic ulcers with recombinant human epidermal growth factor loaded by sustained-release microspheres[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年11期

2 Erik B.Eaton Jr.;Timothy R.Varney;;Mesenchymal stem cell therapy for acute radiation syndrome: Innovative medical approaches in military medicine[J];Military Medical Research;2014年03期

3 Sonia Scarfì;;WJSC 6~(th) Anniversary Special Issues(2):Mesenchymal stem cells Purinergic receptors and nucleotide processing ectoenzymes:Their roles in regulating mesenchymal stem cell functions[J];World Journal of Stem Cells;2014年02期

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本文编号：421865