苔类植物联苄合成相关基因功能鉴定及催化机制研究

发布时间：2017-06-04 23:16

  本文关键词：苔类植物联苄合成相关基因功能鉴定及催化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苔藓植物是介于藻类和蕨类植物之间的一个非常重要的植物类群,可以分为苔纲、藓纲和角苔纲。苔类植物富含萜类和芳香类化合物,化学结构多样并具有多种多样的生物活性,如抗真菌、细胞毒、昆虫拒食、自由基清除等,因此苔类植物成为生物活性天然产物的宝库。但是由于苔类植物本身的生长环境特殊、个体矮小且往往种间杂生,很难富集到大量的高纯度的材料进行研究。分子生物学和代谢工程的发展为解决该问题提供了一个途径。前人通过同位素追踪法提出了苔类植物中双联苄类化合物的生物合成途径,但是对于催化其生物合成反应的关键酶研究的还比较少,因此,寻找催化苔类植物次级代谢产物生物合成的关键酶,阐明重要次级代谢物的生物合成途径,通过代谢工程手段提高天然活性产物的含量,是解决活性化合物来源的一个重要途径。本研究通过筛选cDNA文库EST测序以及转录组测序等方法得到了钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)和粗裂地钱(Marchantia paleacea)中联苄类化合物生物合成途径的关键酶基因,并对其中几个进行了详细研究。包括苯丙烷代谢途径的第一个关键酶苯丙氨酸裂解酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL),鉴定了其体外生化特征并对非生物胁迫条件下PAL的表达与联苄含量的关系进行了初步探讨；克隆了两个细胞色素P450基因,对其基因结构、表达特征进行了分析,发现其与联苄生物合成具有一定的相关性；对苔类植物中克隆得到的两类羧酸芪类合成酶(stilbenecarboxylate synthase, STCS) STCS1和STCS2的进行了体外酶活分析,对其底物选择性进行了初步探讨,并获得了STCS1的蛋白晶体,收集到高分辨数据,对其可能的选择机制进行了初步阐述。主要研究内容和结果包括：1.苔类植物联苄合成途径——苯丙烷代谢途径的第一个关键酶,苯丙氨酸裂解酶(PAL)的克隆及功能研究从钝鳞紫背苔cDNA文库EST测序结果中得到一个注释为苯丙氨酸裂解酶(PAL)的基因片段,通过5'RACE方法得到其全长cDNA序列,生物信息学分析显示,与其他植物来源的PALs具有60-75%的同源性,具有Ala-Ser-Gly催化三联体和其他保守活性氨基酸,同源建模模拟得到其三维结构模型,与来自欧芹的PcPAL整体折叠和保守结构域类似,这些分析表明其是一个苯丙氨酸裂解酶,命名为PaPAL。对其进化地位进行分析,结果表明PaPAL与蕨类、苔藓类和裸子植物的PALs亲缘关系比较近,与传统的植物进化进程一致。另外,以基因组DNA为模板扩增得到基因序列,与cDNA序列比对发现,基因编码区只有一个外显子,没有内含子。构建PaPAL的原核表达载体并且转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白的诱导表达。对纯化后的蛋白进行体外酶活鉴定,结果显示PaPAL能够高效的催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸,并能够以L-酪氨酸为底物产生对羟基肉桂酸,是一个双功能酶,但对两种底物的催化效率有差别,酶学动力学分析表明L-苯丙氨酸是PaPAL的最适底物。此外,PaPAL的表达受到激素茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)的诱导,而且激素诱导条件下叶状体联苄含量与PaPAL的表达有一定的正相关。2.查尔酮合成酶家族基因的克隆和功能研究通过对粗裂地钱在特定配子体阶段转录组进行测序,得到一些标注为查尔酮合成酶基因的序列,选取其中4个克隆进行全长cDNA序列扩增,得到基因序列和数据库中的MpSTCS1,2具有较高同源性,因此被命名为MPaSTCS1-4。对克隆得到的STCSs序列进行分析,它们与其他CHSs有很高的同源性,并具有保守的催化位点Cys-His-Asn及其他保守氨基酸,表明他们都属于CHS超家族,可能具有查尔酮合成酶功能。构建STCSs基因的原核表达体系,得到纯化的蛋白并进行体外酶活检测,发现这4个STCSs根据催化底物酶活效率的不同可以分为两类。以二氢对羟基香豆酰辅酶A (dihydro-p-coumaroyl-CoA)为起始底物,它们都能够发生C6/C1环化生成根皮素(phloretin)和内酯化产物dihydro-4-coumaroyltriacetic acid lactone (dihydro-CTAL)和dihydrobisnoryangonin (dihydro-BNY)。但是以对羟基香豆酰辅酶A (p-coumaroyl-Co A)为起始底物时,MPaSTCS2能够催化发生C6/C1环化生成柚皮素,而另外3个STCSs与STCS2催化效率相差很大,只能生成痕量的柚皮素(质谱检测到),主要产物是内酯化的α-吡喃酮衍生物CTAL和BNY。这两类STCSs对这两种底物具有明显的选择性,但是现有的研究结果还无法解释这种差异的来源,我们期望从结构角度来解释这种差异,并进一步阐明催化机制。我们选取MPaSTCS1进行进一步的晶体学研究。3.对STCS1蛋白的初步晶体学研究利用大肠杆菌系统进行STCS1表达,纯化得到大量单一的STCS1蛋白,初步筛选得到微晶。然后优化结晶条件,得到较大的晶体进行衍射实验,获得2.4A高分辨的衍射数据,通过分子置换、模型修正等方法,得到STCS1蛋白的晶体结构。STCS1的晶体结构呈现功能二聚体形式,每个不对称单位中含有六个STCS1分子。STCS1单体包含上下两个结构域,总体呈现出αβαβα假对称模式,上下部分之间有一个裂缝,形成活性空腔。将其与同源蛋白MpSTCS2和MsCHS进行结构比对,发现三者的三维结构非常类似,仅在活性位点附近有细微的差别。将STCS1晶体结构分别与底物和产物分子进行对接,分析与底物分子或产物分子相互作用的氨基酸残基及作用特点,并与经典的CHS和底物／产物复合物晶体结构进行比较,寻找STCS1与CHS催化活性位点的差别,从结构角度解释STCS1与CHS对底物选择性差别。4.次级代谢途径相关P450的克隆及功能初步研究分析钝鳞紫背苔cDNA文库EST测序结果,找到几十个标注为细胞色素P450的序列。选取其中几个在愈伤组织、培养的叶状体及野生型叶状体中进行表达分析,发现其中几个基因在联苄含量高的组织中表达量明显升高,推测可能与其联苄的合成代谢相关。选取其中两个基因通过5'RACE方法克隆了它们的全长,并扩增得到它们的cDNA及基因组序列,发现两个基因的编码区都有2个内含子。生物信息学分析显示,它们属于P450家族,与CYP75家族具有较高的同源性,具有P450的保守结构域,包括高度保守的血红素结合部位FxxGxRxCxG和另外几个P450s的标志性结构域和序列A/GGxD/ETT/S (I-helix), KETLR (K-helix)和PERF/W等。构建了P450s的体外表达及酶活检测体系,为进行下一步体外及体内功能研究提供了基础。此外,这两个P450的表达受到激素的诱导。
【关键词】：苔类植物 次级代谢途径 苯丙氨酸氨裂解酶 查尔酮合成酶 羧酸芪类合成酶 P450 蛋白晶体 非生物胁迫
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要7-11
• Abstract11-15
• 符号说明15-16
• 第一章 文献综述16-48
• 1 苔藓植物16-17
• 2 苔类植物组织培养的应用17-18
• 3 联苄类化合物次级代谢途径研究18-20
• 3.1 联苄及双联苄类化合物(Bibenzyls and Bisbibenzyls)18-19
• 3.2 联苄类化合物生物合成途径研究19-20
• 4 苔类植物次级代谢途径关键酶20-37
• 4.1 苯丙氨酸裂解酶20-22
• 4.2 肉桂酸-4-羟化酶22-23
• 4.3 4-香豆酸：辅酶A连接酶23
• 4.4 Ⅲ型聚酮合酶家族23-33
• 4.5 NADPH-依赖的聚酮还原酶33-35
• 4.6 植物细胞色素P45035-37
• 5 本论文立题依据和研究内容37-39
• 参考文献39-48
• 第二章 钝鳞紫背苔苯丙氨酸氨裂解酶(PaPAL)的克隆和功能鉴定及在非生物胁迫应答中的表达特征48-78
• 1 引言48-50
• 2 实验材料与试剂50-53
• 2.1 植物材料50
• 2.2 菌株与质粒50
• 2.3 酶和试剂50-51
• 2.4 主要溶液和培养基51-52
• 2.5 实验仪器和设备52
• 2.6 PCR引物序列52-53
• 3 实验方法53-58
• 3.1 钝鳞紫背苔中苯丙氨酸裂解酶PaPAL的克隆53-54
• 3.2 PaPAL的原核表达54-56
• 3.3 PaPAL体外酶活鉴定56-57
• 3.4 PaPAL在非生物胁迫应答中的反应57-58
• 3.5 在非生物胁迫应答中植物叶状体成分的变化58
• 4 实验结果58-73
• 4.1 钝鳞紫背苔中PaPAL的克隆及序列分析58-66
• 4.2 原核表达载体构建及蛋白表达纯化66-68
• 4.3 体外活性检测结果68-70
• 4.4 非生物胁迫条件下PaPAL的表达变化及对成分的影响70-73
• 5 本章小结73
• 参考文献73-78
• 第三章 苔类植物STCSs蛋白功能研究78-97
• 1 引言78-79
• 2 实验材料与方法79-82
• 2.1 植物材料及菌株与质粒79
• 2.2 PCR引物序列79-80
• 2.3 粗裂地钱转录组测序分析80
• 2.4 目的基因cDNA及基因组DNA全长扩增80
• 2.5 原核表达载体构建及蛋白表达80
• 2.6 体外酶活鉴定80-82
• 3 实验结果与讨论82-94
• 3.1 STCSs的克隆和序列分析82-86
• 3.2 STCSs进化树分析86-88
• 3.3 STCSs基因组分析88-89
• 3.4 原核表达89-90
• 3.5 体外酶活结果与分析90-94
• 4 本章小结94-95
• 参考文献95-97
• 第四章 STCS1蛋白功能及初步晶体学研究97-127
• 1 引言97-98
• 2 实验材料与方法98-105
• 2.1 菌株与质粒98-99
• 2.2 试剂和仪器99
• 2.3 培养基和溶液配制99-100
• 2.4 蛋白表达载体构建100
• 2.5 蛋白表达检测及大量制备100-102
• 2.6 STCS1晶体的获得102-104
• 2.7 晶体结构的解析104-105
• 3 实验结果与讨论105-124
• 3.1 STCS1蛋白表达与小量制备105-109
• 3.2 STCS1蛋白大量制备109-111
• 3.3 STCS1蛋白晶体的获得与数据收集111-115
• 3.4 晶体结构与模型修正115-117
• 3.5 STCS1整体结构描述117-120
• 3.6 STCS1与同源序列比对120-121
• 3.7 STCS1与底物及产物分子对接121-123
• 3.8 STCS1活性位点与催化机制探讨123-124
• 4 本章小结124
• 参考文献124-127
• 第五章 联苄合成途径相关P450克隆及功能研究127-148
• 1 引言127
• 2 实验材料与方法127-132
• 2.1 植物材料及菌株与质粒127-128
• 2.2 试剂溶液、酶等128
• 2.3 PCR引物序列128-129
• 2.4 苔类植物不同类型的组织P450表达差异129
• 2.5 基因克隆及序列分析129-130
• 2.6 酵母表达、微粒体制备130-132
• 2.7 体外酶活检测132
• 2.8 两个P450基因在激素处理后的表达特征132
• 3 实验结果132-144
• 3.1 苔类植物中P450在不同组织差异表达分析132-133
• 3.2 苔类植物中两个P450的克隆及序列分析133-140
• 3.3 PaF3'H1与PaF3'H2进化分析140-141
• 3.4 P450酵母表达载体构建及转化141
• 3.5 微粒体制备及体外酶活检测141-143
• 3.6 激素刺激因子引起P450表达的变化143-144
• 4 小结144-145
• 5 下一步工作计划145
• 参考文献145-148
• 致谢148-149
• 攻读学位期间发表的学术论文目录149-150
• 学位论文评阅及答辩情况表150

【参考文献】

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1 武一凤;钝鳞紫背苔苯丙素及联苄类化合物生物合成机制研究[D];山东大学;2014年

  本文关键词：苔类植物联苄合成相关基因功能鉴定及催化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：422400