自噬和线粒体辅酶Q对脓毒症大鼠心功能的影响及机制研究

发布时间：2017-06-08 10:16

  本文关键词：自噬和线粒体辅酶Q对脓毒症大鼠心功能的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的尽管抗生素治疗和危重症监护技术提高,脓毒症(sepsis)仍然是ICU患者的主要死亡原因。在发达国家脓毒症死亡率仍高达40-60%。脓毒症患者死亡的主要原因为多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome, MODS),心功能紊乱是脓毒症MODS的重要组成部分,有心功能紊乱的脓毒症患者比没有心功能紊乱的患者死亡率高50%。脓毒症之所以有如此高的死亡率,是因为脓毒症的病理生理改变十分复杂,目前研究认为氧化应激、线粒体损伤、过多活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生是脓毒症发病的中心环节,而心脏线粒体占总重量的30%,心脏更易受ROS影响,因此认为线粒体受损、ROS产生过多等是脓毒症心功能紊乱的主要原因,但确切发病机制目前尚不为人们所知。自噬的主要功能用于细胞内大分子物质的循环利用、损伤细胞器的清除、胞内病原体的清除,从而维持细胞稳态,保证细胞能量供应,发挥细胞保护性作用,但过度自噬同样可能引起自噬细胞的死亡。有研究报道在脓毒症动物模型和临床患者中观察到心脏自噬的提高,但自噬在脓毒症心功能紊乱中起保护作用或损害作用目前尚不明确。既然氧化应激、线粒体损伤、过多ROS产生是脓毒症心功能紊乱的主要因素,因此理论上抗氧化剂被认为是最有希望改善脓毒症心功能紊乱的治疗措施,但抗氧化剂在临床实验和动物实验中并未取得满意效果,认为可能与这些抗氧化剂在体内被代谢不能到达氧化应激发生的主要部位线粒体有关。线粒体辅酶Q (mitochondrial coenzyme Q, MitoQ)是主要针对线粒体的靶向抗氧化剂,可能对ROS所致的器官组织损伤更具有保护效率。本研究通过对脂多糖(lipopolysaccharide, LP S)诱导的脓毒症大鼠体内及体外急性分离心肌细胞的研究,旨在了解自噬在脓毒症大鼠心功能障碍中的作用及功能变化；自噬是否通过缓解内质网应激改善LPS所致心肌细胞收缩舒张功能障碍；MitoQ是否通过清除ROS影响自噬功能,进而对LPS所致心肌细胞收缩舒张功能障碍起保护作用。方法1.自噬和MitoQ对脓毒症大鼠生存率的影响将SD雄性大鼠按随机数字表法随机分为5组：LPS组、LPS+渥曼青霉素(Wortmannin)组、LPS + MitoQ组、Wortmannin组、MitoQ组,每组10只。LPS组、LPS+ Wortmannin组、LPS+ MitoQ组每只大鼠给LPS (10 mg/kg)腹腔注射,Wortmannin组、MitoQ组给等量生理盐水(NS)注射。腹腔注射后1h采用尾静脉分别给Wortmannin (2 mg/kg)、MitoQ (6.5 μmol/kg)或等量NS注射。腹腔注射后12h每隔1h观察动物生存情况。2.自噬和MitoQ对脓毒症大鼠心功能的影响2.1实验动物模型及分组将SD大鼠随机分10组：对照4h、6h组,LPS 4 h、6 h、8 h、12 h组,LPS + Wortmannin 4 h组,Wortmannin 4 h组,LPS + MitoQ 6 h组,MitoQ 6 h组,每组10只大鼠。所有含LPS组均给LPS(10 mg/kg)腹腔注射,对照组、Wortmannin4h组、MitoQ 6 h组则给等容量NS腹腔注射。大鼠腹腔注射后1h采用尾静脉注射分别给Wortmannin (2mg/kg)、MitoQ (6.5 μmol/kg)干预,其它各组则给等量NS相同处理。2.2大鼠颈总动脉插管及数据记录各组大鼠在相应时间点前30分钟给10%水合氯醛0.3 ml/kg腹腔注射麻醉,分离右侧颈总动脉,插入PE50导管,BL-420E生物机能实验仪记录各组大鼠左室最大收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末压(Left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左室压力上升／下降最大速率(Maximalrate of the rise/drop of left ventricular pressure, ±dp/dt max)。2.3血浆样本收集及心肌组织形态学检查左心室压力测定后,腹主动脉留取血标本,分离血浆置于-70℃冰箱中保存待检。采血后迅速取出心脏用冷PBS液充分冲洗后,一部分心肌组织用于HE染色,另一部分心肌组织用于制备电镜标本,剩余心肌组织液氮速冻,置于-70℃冰箱中保存备用。2.4血浆肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)含量检测采用美国Beckman LX-20全自动生化分析仪检测。2.5血浆及心肌组织中IL-1β、TNF-α、ROS含量检测采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA),操作步骤按照试剂盒说明书进行。2.6心肌组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性检测采用BCA法测蛋白浓度,吸光度法检测Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。2.7心肌组织中LC3、GRP78蛋白的表达采用Western blot法测定。3.自噬通过调控内质网应激缓解LPS所致心肌细胞收缩舒张功能障碍3.1心室肌细胞的分离取健康雄性SD大鼠,腹腔注射肝素2500 U/kg,30 min后,腹腔注射10%水合氯醛0.4 ml/kg麻醉,将Langendorff灌流套管插入主动脉,酶解法分离心室肌细胞,分离的心肌细胞在8h之内使用。根据实验目的的不同,在测定心肌细胞收缩舒张功能、钙瞬变、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、细胞内ROS含量、LC3、GRP78表达等指标前,心肌细胞分别与不同浓度LPS (100ng/ml、200 ng/ml、1 μ/ml、 4 μg/ml)、牛磺脱氧胆酸(TUDCA) (500 μM)、MitoQ(1 μmol/L)、Wortmannin(200nM)37℃共同孵育2 h。3.2大鼠心肌细胞收缩和舒张功能测定采用可视化动缘探测系统(IonOptix)测定各组心肌细胞最大收缩幅度(Peak shortening,PS)、最大收缩速率(+dL/dt)、最大舒张速率(-dL/dt)。3.3大鼠心肌细胞舒张期钙浓度及钙瞬变的同步检测将心肌细胞负载钙离子荧光探针Fluo-4/AM后采用IonOptix系统同步测定心肌细胞舒张期钙及钙瞬变的变化。3.4心肌细胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性检测采用BCA法测蛋白浓度,吸光度法检测Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。3.5心肌细胞上清CK-MB.LDH含量检测取各组心肌细胞上清液,用化学比色法测得CK-MB.LDH含量。3.6心肌细胞内ROS含量检测利用荧光探针2',7'二氯氢化荧光素乙二脂(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)进行活性氧检测,用荧光酶标仪检测荧光强度反映细胞内活性氧的含量。3.7心肌细胞中LC3、GRP78蛋白的表达采用Western blot法。结果1.自噬和MitoQ对脓毒症大鼠生存率的影响及一般表现大鼠腹腔注射LPS后约1h后,出现精神萎靡、腹泻、竖毛、大小便失禁、活动减少、进食、饮水减少等典型内毒素血症临床症状,LPS + MitoQ组上述症状无减轻,LPS + Wortmannin组症状更显著,并出现血尿、血便症状。Wortmannin组、MitoQ组大鼠与正常大鼠一般表现无差别,无死亡。LPS注射后12h内LPS组死亡2只,LPS + MitoQ组死亡4只,LPS + Wortmannin组均死亡.LPS + MitoQ组、LPS + Wortmannin组、LPS组大鼠生存率分别为60%、0、80%,5组间差异有统计学意义(X2=14.882,P=0.001),LPS + Wortmannin组生存率明显低于LPS组,差异有统计学意义(X2=10.208,P=0.001).LPs + Wortmannin组大鼠12h平均生存时间明显短于LPS组(h：7.5±0.64比11.9±0.13,,=19.847,P=0.001),LPS + MitoQ组大鼠12h平均生存时间与LPS组无差异(h：11.6±0.24比11.9±0.13,χ2=1.055,P=0.137)。2.自噬和MitoQ对脓毒症大鼠心功能的影响2.1各组大鼠血浆CK-MB、LDH含量变化大鼠给LPS后6 h出现血浆CK-MB、LDH含量的明显升高与同时间点对照组比较差异有显著性(均P0.05)。给LPS后再给Wortmannin干预4 h即出现CK-MB、LDH含量的明显升高,与LPS 4 h组比较差异有显著性(均P0.05)；而给LPS后再给MitoQ干预CK-MB、LDH含量仍高于同时间点对照组(均P,0.05)。2.2各组大鼠心肌组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的变化大鼠给LPS后6 h出现Ca2+-Mg2+-ATP活力明显下降与同时间点对照组比较差异有显著性(F=3.049,P=0.016)。给LPS后再给Wortmannin干预4 h即出现Ca2+-Mg2+-ATP酶活力明显下降,与LPS 4 h组比较差异有显著性(F=10.221,P=0.001)；而给LPS后再给MitoQ干预Ca2+-Mg2+-ATP酶活力仍低于同时间点对照组(F=4.438,P=0.009),且与同时间点LPS组比较无明显差异(F=4.438,P=0.698)。2.3各组大鼠在体心功能变化LPS注射后6 h大鼠出现心功能异常,表现为LVEDP明显升高,IVSP、±dp/dtmax明显降低,与同时间点对照组比较均有差异(均P0.05)；给LPS后再给Wortmannin 4 h即出现差异(均P0.01),与LPS4h组比较也有差异(均P0.01); LPS + MitoQ 6 h组与对照组比较有差异(均P0.05),但与同时间点LPS组均无差异(均P0.05)。2.4各组大鼠心肌组织病理学改变光镜下,LPS 6 h、8 h、12 h组、LPS + MitoQ 6 h组和LPS + Wortmannin 4 h组均出现明显心肌病理改变。电镜下,LPS 6 h后自噬体增多,MitoQ干预后与相应时间点LPS组无差异,而给予Wortmannin未见自噬体。2.5血浆及心肌组织中IL-1β、TNF-α、ROS含量变化大鼠给LPS后4h出现血浆、心肌组织TNF-α明显升高与同时间点对照组比较差异均有显著性(均P0.05)。给LPS后再给Wortmannin干预血浆、心肌组织TNF-α明显升高,与LPS 4 h组比较差异有显著性(均P0.05)；而给LPS后再给MitoQ干预血浆、心肌组织TNNF-α仍高于同时间点对照组(均P0.05),但与同时间点LPS组比较无明显差异(均P0.05)。大鼠给LPS后6h出现血浆、心肌组织IL-1p明显升高与同时间点对照组比较差异均有显著性(均P0.05)。给LPS后再给Wortmannin干预血浆、心肌组织IL-1β明显升高,与LPS 4 h组比较差异有显著性(均P0.05)；而给LPS后再给MitoQ干预血浆、心肌组织IL-1p仍高于同时间点对照组(均P0.05),但与同时间点LPS组比较无明显差异(均P0.05)。大鼠给LPS后6h出现血浆、心肌组织ROS明显升高与同时间点对照组比较差异有显著性(均P0.05)。给LPS后再给Wortmannin干预血浆、心肌组织ROS明显升高,与LPS 4 h组比较差异有显著性(均P0.05)；而给LPS后再给MitoQ干预血浆、心肌组织ROS仍高于同时间点对照组(均P0.05),但与同时间点LPS组比较无明显差异(均P0.05)。2.6心肌组织中LC3、GRP78表达量的变化大鼠给LPS后6h出现LC3-II表达量的明显增加,与对照组比较有差异(F=10.408,P=0.001),LPS 12 h表达的量有下降趋势,但与LPS 8 h比较无差异(F=10.408,P=0.810).LPS + MitoQ 6 h组与LPS 6 h组比较有差异(F=10.787,P=0.002).GRP78表达的量给LPS后6h明显增加,与对照组比较有有差异(F=7.214,P=0.002),LPS + Wortmannin 4 h组与LPS 4 h组比较有差异(F=10.289,P=0.001).3.自噬通过调控内质网应激缓解LPS所致心肌细胞收缩舒张功能障碍3.1不同浓度LPS对心肌细胞自噬功能影响随着LPS浓度的增高,自噬标志物LC3-II蛋白表达逐步增加,但随着LPS浓度的进一步增高,LC3-II蛋白表达有下降趋势。3.2 Wortmannin对心肌细胞CK-MB.LDH.Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响LPS+Wortmannin组CK-MB、LDH活性显著高于LPS组,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著低于LPS组,差异均有显著性(均P0.05)。给内质网应激特异性抑制剂TUDCA,CK-MB、LDH活性有下降,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性有升高,与LPS + Wortmannin组比较差异均有显著性(均P0.05)。3.3 Wortmannin对心肌细胞内ROS含量的影响LPS + Wortmannin组显著高于LPS组,差异有显著性(F=63.278,P=0.000),给内质网应激特异性抑制剂TUDCA,ROS含量有下降,与LPS + Wortmannin组比较差异有显著性(F=63.278,P=0.000)。3.4 Wortmannin对心肌细胞收缩舒张功能的影响LPS + Wortmannin组PS、±dL/dt显著低于对照组,差异均有显著性(均P0.05),给内质网应激特异性抑制剂TUDCA,PS、±dL/dt有升高,与LPS+Wortmannin组比较差异均有显著性(均P0.05)。3.5 Wortmannin对心肌细胞内钙浓度的影响LPS + Wortmannin组舒张期钙显著高于LPS组,差异有显著性(F=22.869,P=0.000),而钙瞬变显著低于LPS组,差异有显著性(F=92.834,P=0.000)。给内质网应激特异性抑制剂TUDCA,舒张期钙有降低,钙瞬变有升高,与LPS+ Wortmannin组比较差异均有显著性(均P0.05)。3.6 Wortmannin对心肌细胞GRP78表达的影响LPS + Wortmannin组GRP78表达水平显著高于LPS组,差异有显著性(F=5.886,P=0.001)。给内质网应激特异性抑制剂TUDCA,GRP78表达水平显著低于LPS + Wortmannin组,差异有显著性(F=5.886,P=0.043)。3.7 MitoQ对心肌细胞CK-MB、LDH、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响LPS组CK-MB、LDH活性显著高于对照组,而Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著低于对照组,差异均有显著性(均P0.05)。给MitoQ干预LPS + MitoQ组CK-MB、LDH活性无明显下降,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性无明显升高,与LPS组比较差异均无显著性(均P0.05),但与对照组比较均有差异(均P0.05)。3.8 MitoQ对心肌细胞内ROS含量的影响LPS组显著高于对照组,差异有显著性(F=22.753,P=0.000),给MitoQ干预LPS + MitoQ组ROS含量明显下降,与LPS组比较差异有显著性(F=22.753,P=0.003),但仍高于对照组,差异有显著性(F=22.753,P=0.003)。3.9 MitoQ对心肌细胞LC3表达的影响LPS组显著高于对照组,差异有显著性(F=15.019,P=0.000)。LPS + MitoQ组显著低于LPS组,差异有显著性(F=15.019,P=0.011),但仍高于对照组,差异有显著性(F=15.019,P=0.011)。3.10 MitoQ对心肌细胞收缩舒张功能的影响LPS组PS、±dL/dt显著低于对照组,差异均有显著性(均P0.05),LPS+MitoQ组PS、±dL/dt有升高,但仍低于对照组,差异均有显著性(均P0.05)3.11 MitoQ对心肌细胞内钙浓度的影响LPS组舒张期钙浓度明显增加,而钙瞬变幅度明显降低,与对照组比较差异均有显著性(均P0.01)；与LPS组比较LPS + MitoQ组心肌细胞内舒张期钙浓度有降低,钙瞬变幅度有增加,但差异均无显著性(均P0.05),与对照组比较差异均有显著性(均P0.05)。结论1.抑制自噬降低脓毒症大鼠生存率和生存时间,线粒体靶向抗氧化剂MitoQ对脓毒症大鼠生存率和生存时间没有影响。2.脓毒症大鼠心肌组织自噬功能是有限的；抑制自噬可导致脓毒症大鼠出现心功能障碍；自噬可能通过限制促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、炎症介质ROS产生以及降低内质网应激和阻止Ca2+-Mg2+-ATP酶失活,从而改善脓毒症大鼠心功能障碍；线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可降低脓毒症心肌组织自噬功能,对脓毒症大鼠心功能障碍无保护作用。3.自噬对LPS刺激的心肌细胞增强能力是有限的；抑制自噬可造成LPS刺激的心肌细胞结构和功能损伤,影响心肌细胞内钙平衡,导致心肌细胞收缩舒张功能障碍,因而自噬可能对LPS刺激的心肌细胞收缩舒张功能障碍有保护作用；自噬可缓解LPS刺激的心肌细胞内质网应激和ROS产生,提示自噬可能通过改善内质网应激和减少ROS产生而对心肌细胞收缩舒张功能障碍起保护作用；线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可降低LPS刺激的心肌细胞LC3-II的表达和ROS的产生,提示ROS可能是自噬的激活剂之一,MitoQ可能因为降低自噬功能而对LPS所致的心肌细胞收缩舒张功能障碍无保护作用。
【关键词】：自噬 线粒体辅酶Q 心功能 脓毒症 内质网应激 大鼠
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-34
• 参考文献29-34
• 第一章 自噬抑制剂Wortmannin和线粒体靶向抗氧化剂MitoQ对脓毒症大鼠生存率的影响34-45
• 1.1 材料与方法34-35
• 1.2 结果35-36
• 1.3 讨论36-40
• 1.4 参考文献40-45
• 第二章 自噬和MitoQ对脓毒症大鼠心功能的影响45-94
• 2.1 材料与方法45-56
• 2.2 结果56-82
• 2.3 讨论82-87
• 2.4 参考文献87-94
• 第三章 自噬通过调控内质网应激缓解脂多糖所致心肌细胞收缩舒张功能障碍94-130
• 3.1 材料与方法94-100
• 3.2 结果100-123
• 3.3 讨论123-126
• 3.4 参考文献126-130
• 全文小结130-132
• 综述132-159
• 参考文献145-159
• 中英文缩略词表159-161
• 攻读博士学位期间研究成果161-162
• 致谢162-165
• 统计学证明165

  本文关键词：自噬和线粒体辅酶Q对脓毒症大鼠心功能的影响及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：432221