利用光遗传学解析小鼠内侧前额叶皮质相关奖赏环路

发布时间：2017-06-11 05:07

  本文关键词：利用光遗传学解析小鼠内侧前额叶皮质相关奖赏环路，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景及目的:前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)的功能与大脑许多高级功能密切相关,如认知,决策,动机,情感,记忆,社会功能的调节等,心理学中通常将前额叶皮质的功能与人格紧密联系,某种意义上说,前额叶皮质的功能是人之所以区分与其他动物的关键所在。解剖上,前额叶皮质与大脑其他脑区广泛密切联系,包括皮层、皮层下以及脑干等许多区域,形成复杂的神经环路,发挥相应的神经功能。前额叶皮质功能异常与许多精神神经疾病相关,如药物成瘾,精神分裂,抑郁症等。以往的研究,特别是颅内电刺激研究,发现电刺激前额叶皮质的某些区域具有奖赏效应,提示前额叶皮质参与构成奖赏环路,但是鉴于电刺激本身的技术局限性,无法确定前额叶皮质是如何影响具体的奖赏过程的,是通过兴奋前额叶皮质神经元起作用?或是抑制相应神经元?其具体的奖赏环路是如何的?最近的临床研究表明,前额叶皮质与情感动机密切相关,前额叶皮质功能异常与抑郁症密切相关,脑深部电刺激(deep brain stimulation,DBS)前额叶皮质的特定区域(Cg 25区)“纠正”PFC的异常活动,对难治性抑郁症具有良好的治疗效果,但其具体的作用机制不清。光遗传学技术是近年来发明的神经科学领域最前沿的实验技术之一,可以实现选择性的兴奋或抑制特定的神经元,而不直接影响周围的其他神经元及过路纤维,具有极高的时间和空间分辨率,是解析介导特定行为的具体神经环路的强有力工具。本研究主要利用光遗传学技术解析前额叶皮质相关的奖赏环路,以期对前额叶皮质的功能更进一步的理解,有助于临床治疗前额叶皮质功能异常相关的神经精神疾病,特别是药物成瘾和抑郁症。方法:本研究主要利用光遗传学技术,小鼠在体多通道胞外电信号记录,自由活动小鼠在体FSCV法多巴胺检测技术结合经典的奖赏动物行为学研究方法(自身按杆实验),采用4种带有Cre重组酶标记的转基因小鼠,结合Cre重组酶依赖的病毒载体表达光敏感蛋白策略,实现选择性调控特异类型神经元。实验分为四部分,分别探讨前额叶皮质在奖赏中的作用,其不同类型神经元在奖赏过程中扮演的角色,前额叶相关奖赏环路的具体构成以及在奖赏中具有重要作用的神经递质多巴胺在前额叶相关奖赏过程中的作用。结果:实验一(1)兴奋位于m PFC(DP,Pr L,MO)及DTT和VTT神经元,小鼠可以迅速学会自身按杆以获得颅内激光刺激兴奋神经元,激光关闭后,小鼠自身按杆行为显著减少,重新开启激光后,自身按杆次数恢复甚至超过之前最高水平,提示激活m PFC及DTT和VTT神经元具有奖赏作用。(2)兴奋位于m PFC上方(cg1/M2)以及外侧区域(VO/LO)神经元,小鼠无法学会自身按杆,提示兴奋这些脑区的神经元不具有奖赏作用。(3)互换按杆的激光匹配后,小鼠可迅速学会自身按杆,提示小鼠的自身按杆行为是与兴奋特定神经元相关。(4)不同激光刺激频率的奖赏作用各异,50 Hz和25 Hz对自身按杆作用均显著强于12.5 Hz和6.25 Hz(p0.0001)。(5)在体多通道胞外单细胞记录显示,激光刺激强度强度0.1--10 m W,频率在6.25 Hz,12.5 Hz,25 Hz和50 Hz均能引起神经元放电,神经元的放电活动与激光刺激时间序列一一对应,神经元的放电频率与激光刺激的频率一致。实验二(1)兴奋位于m PFC的v Glut1阳性神经元支持自身按杆行为,30 min按杆次数可达501.83±359.27,具有较强奖赏作用。(2)兴奋位于m PFC(DP)的v Glut2阳性神经元支持自身按杆行为,30 min按杆次数为198.25±117.99,显著低于兴奋v Glut1阳性神经元,具有一定程度的奖赏作用。(3)兴奋位于m PFC的v GAT阳性神经元需较强的激光刺激(25 Hz,72 pulses)才能支持较弱的自身按杆行为。(4)CPP结果显示,兴奋v GAT阳性神经元具有奖赏作用。实验三(1)兴奋m PFC向纹状体(m CP,Ac Sh)的投射支持自身按杆行为,提示激活该神经通路具有奖赏作用。(2)兴奋m PFC通过内囊(ic)的投射支持自身按杆行为,提示该神经通路具有奖赏作用。(3)兴奋m PFC向丘脑(VM、MD)下丘脑(LHA)的投射支持自身按杆行为,提示该神经通路具有奖赏作用。(4)局部(m CP)药理学阻断可以显著降低由兴奋m PFC--m CP投射引起的自身按杆行为,提示m CP神经元直接参与奖赏作用,是奖赏环路中的重要结点。实验四(1)剂量足以阻断VTA多巴胺能神经元奖赏作用的多巴胺D1受体和D2受体阻断剂,对兴奋m PFC产生的奖赏作用无显著影响,提示m PFC的奖赏效应是不依赖于多巴胺的。(2)成功实现了在清醒自由活动小鼠利用FSCV法实时检测纹状体多巴胺浓度。(3)FSCV法检测DA浓度显示,电刺激mfb可显著增高纹状体DA浓度,而光遗传学刺激表达Ch R2的m PFC神经元对纹状体DA浓度无显著影响,提示光遗传学激活m PFC神经元并不引起纹状体DA释放。结论:(1)首次利用光遗传学技术发现直接激活小鼠内侧前额叶皮质神经元具有很强的奖赏作用,并明确了最佳的光遗传学刺激参数。(2)m PFC的奖赏作用主要由兴奋性神经元v Glut1阳性神经元介导,v Glut2阳性神经元也起到部分作用,而激活抑制性神经元v GAT阳性神经元的总效应为奖赏效应,并非厌恶效应。(3)利用光遗传学技术在神经环路研究中的优势,首次发现m PFC---m CP和m PFC---ic两条通路在奖赏中具有重要作用,其奖赏作用程度不亚于经典的m PFC---Ac Sh通路。(4)首次利用光遗传学技术结合清醒自由活动小鼠FSCV法研究多巴胺在m PFC介导的奖赏效应中的作用,发现m PFC介导的奖赏作用不依赖于脑内多巴胺的释放,光遗传学刺激m PFC不引起纹状体多巴胺的释放增多,对目前以多巴胺为核心的奖赏理论形成良好的补充。
【关键词】：光遗传学 内侧前额叶皮质 奖赏环路 多巴胺 动机 自身按杆 快速扫描循环伏安法
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338
【目录】：

• 缩略语表7-11
• 中文摘要11-15
• 英文摘要15-20
• 前言20-21
• 文献回顾21-50
• 1 光遗传学21-42
• 1.1 发展简史21-23
• 1.2 基本原理23-24
• 1.3 光遗传学工具24-30
• 1.4 导入神经系统30-31
• 1.5 转基因动物31
• 1.6 皮层特异性表达31-32
• 1.7 靶向调控神经环路32
• 1.8 光刺激与读出设备32-33
• 1.9 模式动物33-36
• 1.10 在精神类疾病研究中的应用36-42
• 2 前额叶皮质42-45
• 2.1 解剖结构43
• 2.2 纤维联系43-44
• 2.3 主要功能44-45
• 2.4 临床意义45
• 3 奖赏环路45-50
• 3.1 颅内电刺激45-46
• 3.2 多巴胺的作用及假说46-50
• 实验一 前额叶皮质及周围脑区在奖赏中的作用50-70
• 前言50
• 1 材料50-51
• 1.1 实验动物50
• 1.2 主要试剂50-51
• 1.3 主要器材51
• 2 方法51-55
• 2.1 动物分组51
• 2.2 立体定向手术51-52
• 2.3 自身按杆行为学实验52-53
• 2.4 激光参数53
• 2.5 互换按杆实验53
• 2.6 不同光刺激频率实验53
• 2.7 固定比率自身按杆实验53
• 2.8 多通道光电极记录实验53-54
• 2.9 组织学54
• 2.10 统计学处理54-55
• 3 结果55-64
• 3.1 兴奋内侧前额叶皮质及周围脑区对小鼠自身按杆的影响55-57
• 3.2 按杆互换实验57-58
• 3.3 不同激光刺激频率对自身按杆行为的影响58-60
• 3.4 固定比率自身按杆试验60-61
• 3.5 在体多通道记录61-62
• 3.6 组织学结果62-64
• 4 讨论64-69
• 4.1 趋近动机(approach motivation)、奖赏(reward)和强化(reinforcement)65-66
• 4.2 内侧前额叶皮质在奖赏中的作用66-67
• 4.3 光遗传学研究中刺激参数的选择67-69
• 5 小结69-70
• 实验二 内侧前额叶皮质不同类型神经元在奖赏中的作用70-81
• 前言70
• 1 材料70-71
• 1.1 实验动物70-71
• 1.2 主要试剂71
• 1.3 主要器材71
• 2 方法71-73
• 2.1 动物分组71-72
• 2.2 立体定向手术72
• 2.3 自身按杆行为学实验72
• 2.4 操作性位置偏爱实验72-73
• 2.5 激光参数73
• 2.6 组织学73
• 2.7 统计学处理73
• 3 结果73-78
• 3.1 v Glut1阳性神经元兴奋对自身按杆的影响73-74
• 3.2 v Glut2阳性神经元兴奋对自身按杆的影响74-75
• 3.3 v GAT阳性神经元兴奋对自身按杆的影响75-76
• 3.4 v GAT阳性神经元兴奋对位置偏爱的影响76-77
• 3.5 增加刺激强度兴奋v GAT阳性神经元对自身按杆的影响77
• 3.6 组织学结果77-78
• 4 讨论78-80
• 小结80-81
• 实验三 内侧前额叶皮质不同投射区在奖赏中的作用81-91
• 前言81
• 1 材料81-82
• 1.1 实验动物81
• 1.2 主要试剂81
• 1.3 主要器材81-82
• 2 方法82-84
• 2.1 动物分组82
• 2.2 立体定向手术82-83
• 2.3 自身按杆行为学实验83
• 2.4 激光参数83
• 2.5 局部药理学阻断实验83-84
• 2.6 组织学84
• 2.7 统计学处理84
• 3 结果84-88
• 3.1 兴奋m PFC向纹状体(m CP，Ac Sh)投射对自身按杆的影响84-85
• 3.2 兴奋m PFC在内囊前肢的投射对自身按杆的影响85-86
• 3.3 兴奋m PFC向丘脑及下丘脑的投射对自身按杆的影响86-87
• 3.4 m CP局部药理学阻断对兴奋m PFC--m CP投射自身按杆的影响87-88
• 3.5 组织学结果88
• 4 讨论88-90
• 小结90-91
• 实验四 多巴胺在内侧前额叶皮质相关奖赏环路中的作用91-101
• 前言91
• 1 材料91-92
• 1.1 实验动物91
• 1.2 主要试剂91
• 1.3 主要器材91-92
• 2 方法92-95
• 2.1 动物分组92
• 2.2 立体定向手术92-93
• 2.3 自身按杆行为学训练93
• 2.4 全身多巴胺受体阻断实验93-94
• 2.5 FSCV电极制作94
• 2.6 FSCV法在自由活动小鼠测DA浓度94
• 2.7 组织学94
• 2.8 统计学处理94-95
• 3 结果95-97
• 3.1 全身阻断多巴胺对m PFC组和VTA组小鼠自身按杆的影响95-96
• 3.2 FSCV法测DA浓度96-97
• 4 讨论97-100
• 小结100-101
• 参考文献101-117
• 个人简历和研究成果117-119
• 致谢119-120

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