高压氧联合人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

发布时间：2017-06-13 18:00

  本文关键词：高压氧联合人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分人脐带间充质干细胞的提取、培养与鉴定目的：研究由人脐带华通胶组织(Wharton's jelly)在体外分离、培养、扩增获得脐带间充质干细胞((umbilical cord derived mesenchymal stem cells,简称HUCMSCs)的方法,并进行HUCMSCs的各项鉴定。方法：脐带华通胶组织采用胶原酶以及胰酶序贯消化法分离得到HUCMSCs,用流式细胞仪等分析其表型特征,向成骨、成脂以及成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果：由人脐带华通胶可以有效获得间充质干细胞。原代细胞培养24-48 h内细胞开始贴壁生长,5-7 d左右可以传代培养,在2-3周时间内可以迅速扩增至10'到108数量级。各项分化鉴定试验证实HUCMSCs具有多向分化潜能,向成骨、成脂以及成软骨细胞。HUCMSCs在体外培养传至20-30代仍保持稳定的细胞表面标记。结论：由人脐带华通胶可以有效地获得间充质干细胞,这种HUCMSCs能在体外长期传代培养,生物学特性稳定,具有多向分化的潜能,是今后细胞治疗很有前景的种子细胞。第二部分人脐带间充质干细胞向神经干细胞的转分化研究目的：探讨诱导HUCMSCs向神经干细胞分化的方法,并对HUCMSCs转分化而来的神经干细胞(HUCMSCs-NSCs)进行形态学、组织学和功能学鉴定,为NSCs临床移植治疗SCI的研究提供细胞来源。方法：用表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)和N2对HUCMSCs进行预诱导；比较预诱导和未经诱导的HUCMSCs向神经干细胞方向分化的效率。然后用人成纤维生长因子-2(Human basic fibroblast growth factor-2, FGF2),表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)将预诱导后的HUCMSCs向神经干细胞方向分化。然后用免疫荧光化学、western blot对HUCMSCs-NSCs进行组织学鉴定。结果：通过本实验方案成功将HUCMSCs诱导为神经干细胞,经过预诱导后的HUCMSCs分化为神经干细胞的效率明显提高,首先,nestin的表达在预诱导后HUCMSCs显著高于未诱导的HUCMSCs(P0.001);其次,在诱导后15d,比较神经球的直径大小(P0.001)和神经球的nestin阳性率(P0.001),在预诱导后HUCMSCs和未诱导的HUCMSCs之间比较,差异有显著性。所有免疫组织化学结果均经过Western blot验证。HUCMSCs-NSCs表达干细胞标记物nestin。结论：通过本实验成功建立了诱导HUCMSCs向NSCs分化的方案,HUCMSCs-NSCs具备大部分神经系统来源NSCs的典型特征,为NSCs用于临床移植治疗SCI解决了来源问题。但HUCMSCs-NSCs与中枢神经来源的NSCs尚存在一定差别,当前的方案仍需要进一步改进。诱导；比较预诱导和未经诱导的HUCMSCs向神经干细胞方向分化的效率。然后用人成纤维生长因子-2(Human basic fibroblast growth factor-2, FGF2),表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)将预诱导后的HUCMSCs向神经干细胞方向分化。然后用免疫荧光化学、western blot对HUCMSCs-NSCs进行组织学鉴定。结果：通过本实验方案成功将HUCMSCs诱导为神经干细胞,经过预诱导后的HUCMSCs分化为神经干细胞的效率明显提高,首先,nestin的表达在预诱导后HUCMSCs显著高于未诱导的HUCMSCs(P0.001);其次,在诱导后15d,比较神经球的直径大小(P0.001)和神经球的nestin阳性率(P0.001),在预诱导后HUCMSCs和未诱导的HUCMSCs之间比较,差异有显著性。所有免疫组织化学结果均经过Western blot验证。HUCMSCs-NSCs表达干细胞标记物nestin。结论：通过本实验成功建立了诱导HUCMSCs向NSCs分化的方案,HUCMSCs-NSCs具备大部分神经系统来源NSCs的典型特征,为NSCs用于临床移植治疗SCI解决了来源问题。但HUCMSCs-NSCs与中枢神经来源的NSCs尚存在一定差别,当前的方案仍需要进一步改进。第三部分 高压氧联合人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤目的：探讨以人脐带间充质干细胞移植同时应用高压氧治疗大鼠脊髓损伤,观察联合作用对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响。方法：SD大鼠80只,以钳夹法制成脊髓损伤大鼠模型。随机分成假手术对照组、假移植组、HUCMSCs移植组及HUCMSCs+HBOT移植组,每组20只。伤后第10天取材行MPO活性测定及ELISA检测损伤局部炎症因子,移植细胞后第28天行的神经营养因子的表达、存活和分化检测。造模后1,2,3,4周进行BBB评分运动功能检测。结果：高压氧联合人脐带间充质干细胞治疗组的疗效最为显著,运动学评分、炎症因子表达降低程度、神经营养因子的含量均优于其他治疗组。结论：高压氧和人脐带间充质干细胞两种治疗措施联合能发挥协同作用,增强治疗效果。第四部分高压氧对大鼠脊髓损伤后巨噬细胞极化和神经保护的影响目的：探讨在脊髓损伤(SCI)后高压氧治疗(HBOT)的效果,尤其是侧重于其对巨噬细胞活化和细胞凋亡的影响。方法：建立T10脊髓钳夹损伤动物模型。大鼠随机分为三组：(A)假手术组,(B)SCI+常压空气组(NBA组；21%氧气、1个绝对大气压,ATA),(C) SCI+短期高压氧组(于手术后即行100%氧气、2.8个绝对大气压的急性期治疗,90分钟/次,2次/天,共3天)。分别检测三组模型的巨噬细胞活化、细胞凋亡、组织防护和功能恢复情况。结果：SCI环境下HBOT带来显著性变化,M2亚型的数量和水平显著提升：(精氨酸酶-1(Arg-1)-阳性),同时M1亚型的数量下降(诱导型一氧化氮合酶(iNOS)-阳性)。这与同步发生的髓过氧化物酶(MPO)活性的衰减、细胞凋亡的抑制(原位缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞,Caspase-3基因和Bax蛋白的表达)和致炎因素(如白介素1β(IL-1β)?肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素17(IL-17))的下调有关。勒克司坚牢蓝(LFB)和GAP-43染色结果显示,高压氧治疗组的髓鞘形成和轴突再生的水平明显高于常压空气组。这些变化与功能恢复的提升紧密相关。结论：高压氧治疗可以提升M2巨噬细胞活性,有效地减少脊髓损伤相关炎症的发生,这可能会进一步抑制细胞凋亡,促进神经保护并有助于大鼠脊髓损伤后的功能恢复。
【关键词】：间充质干细胞 脐带 华通胶 诱导分化能 脐带间充质 神经干细胞 分化 脊髓损伤 人脐带间充质干细胞 移植 高压氧 运动功能 脊髓损伤 高压氧治疗 继发性损伤 巨噬细胞极化 凋亡 炎症
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 第一部分 人脐带间充质干细胞的提取、培养与鉴定13-38
• 引言13-14
• 材料和方法14-27
• 结果27-33
• 讨论33-35
• 结论35
• 参考文献35-38
• 第二部分 人脐带间充质干细胞向神经干细胞的转分化研究38-61
• 引言38-39
• 材料和方法39-47
• 结果47-56
• 讨论56-58
• 结论58
• 参考文献58-61
• 第三部分 高压氧联合人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤61-88
• 引言61-62
• 材料和方法62-75
• 结果75-79
• 讨论79-83
• 结论83
• 参考文献83-88
• 第四部分 高压氧对大鼠脊髓损伤后巨噬细胞极化和神经保护的影响88-97
• 引言88
• 材料和方法88-91
• 结果91-94
• 讨论94-95
• 结论95-96
• 参考文献96-97
• 综述97-103
• 参考文献100-103
• 发表论文103-104
• 致谢104

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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  本文关键词：高压氧联合人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：447164