内皮细胞源性KLF15调控TM激活蛋白C抗凝血途径及MCP-1介导炎性反应影响DVT形成的实验研究

发布时间：2017-06-23 20:13

  本文关键词：内皮细胞源性KLF15调控TM激活蛋白C抗凝血途径及MCP-1介导炎性反应影响DVT形成的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本课题组前期已建立大鼠、兔等DVT动物模型,并通过基因芯片检测技术对血栓形成/不形成相关基因进行了筛选分析,我们发现内皮细胞活化、凝血/抗凝系统失衡及炎症反应与DVT形成之间关系密切。结合经典文献关于DVT的研究,本课题就锌指样转录因子15(KLF15)、炎性因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、抗凝血因子血栓调节蛋白(TM)、活化蛋白C (APC)在DVT形成中的作用及其调控关系从动物实验及细胞实验方面进行研究。动物实验中,对KLF15、MCP-1、TM、APC在下腔静脉狭窄法DVT小鼠静脉壁组织及APC在小鼠血浆中的表达变化和其作用作一初步研究：细胞实验中,在凝血酶(Thrombin)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型中,siRNA干扰KLF15表达,研究其与下游TM的调控关系；入脐静脉内皮细胞中沉默/过表达MCP-1,研究其调控的下游关键基因及信号通路变化,分析上述变化与DVT形成的关系。目的：1.建立C57小鼠下腔静脉狭窄法DVT模型,造模后24小时获取小鼠下腔静脉壁组织并采集血液分离血浆,HE染色观察造模小鼠建模后血栓形成情况并检测静脉壁组织中KLF15、MCP-1、TM、APC及血浆中APC在DVT形成前后的表达变化,分析其与DVT形成的关系；2.研究Thrombin对HUVECs表达KLFs家族关键成员及下游凝血/抗凝、炎症、粘附因子的影响；确定Thrombin诱导HUVECs表达KLF15的最适浓度及时间点位；研究Thrombin静脉内皮细胞损伤模型中siRNA干扰抑制KLF15表达后,其与下游基因TM的调控关系；3.构建MCP-1过表达/干扰载体,转染人脐静脉内皮细胞,研究其下游基因及信号通路变化与DVT形成的关系。方法：1.120只C57小鼠分为正常组40只、假手术组40只、DVT组40只,DVT组采用下腔静脉狭窄法造模,造模24小时后获取小鼠下腔静脉组织并采集血液分离血浆；real-time PCR法检测KLF15、MCP-1、TM的表达,ELISA法检测静脉组织及血浆中APC的表达；获取的下腔静脉组织HE染色观察血栓形成情况。2.以0、2、4u/ml浓度的Thrombin分别处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)8小时,检测KLF2、KLF4、 KLF5、 KLF6、 KLF10、KLF11、KLF15表达；检测Thrombin不同浓度(0.2u/ml、4u/ml、8u/ml)处理内皮细胞8小时,以及Thrombin (4u/ml)作用不同时间(0、4h、8h、12h)后KLF15的表达,确定在Thrombin诱导静脉内皮细胞表达KLF15最适浓度及时间点位；以4u/ml浓度的Thrombin处理HUVEC细胞8小时后检测抗凝因子(TM)、抗纤溶因子(PAI-1)、粘附因子(VCAM)的表达;siRNA干扰KLF15后,检测下游TM、PAI-1及VCAM表达,研究KLF15与下游基因的调控关系。3.培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),行MCP-1免疫荧光及免疫共沉淀检测,构建人MCP-1过表达/干扰载体MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP-shRNAmirl经病毒转染后感染HUVECs,检测转染效率,行基因芯片检测研究其下游的基因及信号通路变化与DVT形成的关系。结果：1.DVT组成栓率85.3%、死亡率15%、狭窄率90.8%±0.8%、残余管腔横截面积百分比9.2%±0.8%、血栓长度5.85+0.25mm、血栓湿重0.27+0.02g、下腔静脉直径0.99±0.04mm; real-time PCR检测正常组、假手术组、DVT组小鼠静脉组织中KLF15、MCP-1、TM mRNA表达发现,KLF15、MCP-1在DVT组与正常组、假手术组相比表达上调(P0.05),TM在DVT组与正常组相比表达上调(P0.05),3个基因在正常组、假手术组之间不具统计学意义(P0.05)。ELISA检测正常组、假手术组、DVT组小鼠血浆中APC蛋白的表达发现,APC在DVT组较正常组、假手术组相比表达上调(P0.05), APC在正常组、假手术组之间不具统计学意义(P0.05)。ELISA测定正常组、假手术组、DVT组小鼠静脉组织中APC蛋白的表达发现,APC在DVT组较正常组、假手术组相比表达下调(P0.05), APC在正常组、假手术组之间不具统计学意义(P0.05)。2.以0、2、4u/ml浓度的Thrombin分别处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)8小时后,KLF2、KLF4、KLF5、 KLF6、 KLF10表达显著下调(P0.05)、KLF11、KLF15表达显著上调(P0.05)。以0、2、4、8u/ml浓度的Thrombin处理HUVEC细胞8小时,KLF15在Thrombin浓度4 u/ml时KLF15表达至峰值(P0.05),以4u/ml浓度的Thrombin处理HUVEC细胞0、4、8、12小时,KLF15在4小时及8小时表达上调(P0.05)。Thrombin诱导静脉内皮细胞表达KLF15最适浓度为4u/ml,作用时间为8小时。以4u/ml浓度的Thrombin处理HUVEC细胞8小时后,TM、PAI-1表达较对照组表达上调(P0.05),VCAM较对照组表达下调但无统计学差异(P0.05)。KLF15、TM在Thrombin+KLF15 siRNA组较Thrombin组表达下调(P0.05);PAI-1在Thrombin组与Thrombin+KLF15 siRNA组相比无统计学差异(P0.05),与KLF15调控无关。VCAM在Thrombin组、KLF15 siRNA组及Thrombin+KLF15 siRNA组表达均下调,与KLF15调控无关。3.MCP-1过表达/沉默后,基因芯片检测发现与正常细胞相比,MCP-1过表达组下调的基因有158个,下调的信号通路有18条,上调的基因有71个,上调的信号通路有7条；MCP-1干扰组下调的基因有1390个,下调的信号通路有60条,上调的基因有250个,上调的信号通路有15条。IL-6、MMP-3、MMP-19、VEGF在MCP-1过表达组、MCP-1干扰组中的表达均较正常组细胞有显著变化,表达变化趋势为在MCP-1过表达组中表达上调,在MCP-1干扰组中表达下调。MCP-1过表达组、MCP-1干扰组、正常组细胞比较变化显著的信号通路有MAKP signaling pathways、PI3K-AKT signaling pathways。结论：1.30G针头建立C57小鼠下腔静脉狭窄法DVT模型成栓率高,死亡率低,在造模后24小时可形成完全性血栓,是稳定、可靠的小鼠下腔静脉狭窄法DVT模型。2.DVT形成初期凝血/抗凝血系统失平衡,蛋白C抗凝系统被激活。DVT形成初期MCP-1、TM在血栓形成过程中可能起到重要作用。3.凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞模型中,KLF15可能调控下游TM表达。4.MCP-1在DVT炎症反应中可能与IL-6存在调控或协同作用,在血栓溶解过程中可能与MMP-3、MMP-19存在调控或协同作用,在血管重塑方面可能与VEGF存在调控或协同作用。MCP-1可能通过MAKP和PI3K-AKT信号通路参与内皮细胞炎症反应、血管重塑及血栓消退影响DVT形成。
【关键词】：锌指样转录因子15 单核细胞趋化因子-1 血栓调节蛋白 凝血酶 深静脉血栓形成 静脉内皮细胞 炎症反应
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.6
【目录】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 中英文缩略词表13-15
• 前言15-22
• 第一部分：建立C57小鼠下腔静脉狭窄法DVT模型,检测静脉组织中KLF15、MCP-1、TM、APC及血浆中APC的表达22-50
• 材料和方法22-34
• 结果34-43
• 讨论43-49
• 结论49-50
• 第二部分：Thrombin静脉内皮细胞损伤模型中KLF15与下游TM基因调控关系的研究50-82
• 材料和方法50-59
• 结果59-72
• 讨论72-81
• 结论81-82
• 第三部分：MCP-1转染人脐静脉内皮细胞过表达/沉默研究82-123
• 材料和方法82-96
• 结果96-114
• 讨论114-122
• 结论122-123
• 参考文献123-133
• 附录133-140
• 文献综述140-145
• 参考文献142-145
• 攻读学位期间参加科研及文章发表情况145-146
• 致谢146

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 徐荣丰;高大胜;王红雷;;血清新蝶呤和单核细胞趋化蛋白-1在冠心病患者血清中的表达及意义[J];中国心血管病研究杂志;2007年06期

2 李海燕;郑有光;杨晓芬;程维刚;陈丽萍;;兔急性多发微小肺血栓栓塞症后血清血栓调节蛋白的变化[J];中国老年学杂志;2011年15期

3 宋军锋;陈小平;李润琴;黄阳霞;;MCP-1与急性冠脉综合征患者冠状动脉侧支循环的相关性研究[J];中国医疗前沿;2011年21期

  本文关键词：内皮细胞源性KLF15调控TM激活蛋白C抗凝血途径及MCP-1介导炎性反应影响DVT形成的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：476184