氯化甲基汞慢性暴露对子代海马神经损伤的实验研究

发布时间：2017-07-04 01:16

  本文关键词：氯化甲基汞慢性暴露对子代海马神经损伤的实验研究

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【摘要】：自日本发生水俣病后,氯化甲基汞(Methyl Mercuric Chloride MMC)对人体的危害逐渐引起人们重视。研究发现MMC对神经系统具有强烈毒性作用,且极易通过胎盘进入胎儿体内,在胎、幼儿体内有高水平的蓄积。近年来,对甲基汞的研究逐渐从大规模人群流行病学调查和一般损伤的毒理学研究转向细胞和分子水平,对甲基汞的生殖毒性和遗传毒性的研究已成为甲基汞毒性作用的重要内容之一。妊娠母体接触不足以引起母体任何症状剂量的MMC,其出生后的幼儿出现智能低下、精细行为和运动障碍、神经发育迟缓等症状,而且这种损害是广泛而长期的。研究认为,造成认知功能障碍的主要原因是脑海马受损,而且这种损伤是不可逆的。氢质子磁共振波谱(1H Magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)是一种无创性、可直接观察人体内生化物质改变的新型影像学技术。本研究目的是探索能否运用安全、无创的1H-MRS技术,评估甲基汞慢性暴露后子代大鼠脑海马损伤情况,用HE染色、电镜超微结构改变来验证1H-MRS检查的结果,为氯化甲基汞脑海马损伤的早期临床诊断,病情分析,早期治疗提供理论依据。本实验分两部分进行,分别对子代发育期、性成熟期大鼠进行实验。第一部分方法：SD大鼠共16只(雌雄比3：1),年龄约2月龄,购自武汉大学动物实验中心。合笼后,于次日早晨进入动物房检查雌性大鼠阴栓。随机将受孕雌鼠分为三组,每组4只,分别为高剂量氯化甲基汞组(H-MMC)、低剂量组(L-MMC)、对照组(C-NACL)。自受孕当天开始、每天定时定量分别给予：高剂量组4mg/kg MMC,低剂量组2mg/kg MMc,对照组即C-NaCl组4mg/kg NaCl,给药方式为灌胃给药。给药时间持续至子代大鼠哺乳期结束即子代大鼠约3周龄。染毒结束后,随机抽取3组仔鼠中的4只(不分性别)行右侧海马1H-MRS采集工作。所采用的检查设备为中科院武汉磁共振中心的德国Bruker公司所生产的、7.0 T小动物磁共振成像仪。运用1H-MRS技术对大鼠右侧海马代谢物比值NAA/Cr(N-乙酰天门冬氨酸/肌酸)、CHO/Cr(胆碱/肌酸),mI/Cr(肌醇/肌酸)进行检测。心脏灌注法处死大鼠取出大鼠脑海马组织,用常规HE染色和电子显微镜两种方法观察海马神经元结构和海马超微结构的变化。结果：各组仔鼠的早期生理发育指标(各组仔鼠数量、张耳、切齿萌出、睁眼等)相比,差别无统计学意义。HE染色结果：高剂量组子代大鼠脑皮层疏松水肿,海马大量神经元变性坏死以及核固缩,胶质细胞增生等,还出现大量空泡化。低剂量染毒组：子代大鼠脑皮层少量神经元变性坏死、核固缩,海马出现少量空泡化。对照组海马结构未见异常。电镜结果显示：高剂量组电镜可见部分神经细胞变性明显,线粒体肿胀,海马区神经突起溶解、固缩和神经元细胞核溶解,星形细胞空泡变性等。低剂量组：部分神经细胞变性,可以观测到神经元核形态不规则、核结构不清,胞体固缩以及线粒体变性,突起的髓鞘溶解、微丝和微管部分溶解、线粒体空泡变性等。对照组脑海马区神经细胞组织结构较好。1H-MRS检查：高剂量组NAA/Cr明显降低(P0.05),Cho/Cr、mI/Cr显著升高(P0.05),可见明显乳酸峰。低剂量组NAA/Cr亦降低,Cho/Cr、ml/Cr显著升高(P0.05),可见双乳酸峰,峰值低于高剂量组。高、低剂量组间无显著性差异(P0.05)。第二部分方法：继续饲养上述三组大鼠至性成熟期(约出生9周),每组随机选取8只(不分性别),用Morris水迷宫检测3组大鼠认知功能；连续训练5天,第6天用空间探索实验的目标象限穿梭次数检测三组大鼠记忆和学习方面的认知功能。运用1H-MRS技术对大鼠右侧海马代谢物比NAA/Cr、CHO/Cr、mI/C进行检测。心脏灌注法取出大鼠海马,用HE染色和电子显微镜两种病理检查观察海马神经元结构和海马超微结构改变情况。结果：Morris水迷宫实验高剂量组大鼠在第2-5天找到平台时间多于对照组,在第4-5天找到平台时间多于低剂量组,差异均有统计学意义(P0.05)；低剂量组与对照组相比,差异没有统计学意义。高剂量组穿梭次数(0.63±0.74)明显低于对照组(3.13±1.56),差异有统计学意义(P0.05)：低剂量组穿梭次数(1.00±0.76)与对照组(3.13±1.56)比较,差异没有统计学意义。病理检查：高剂量组HE染色皮层疏松水肿,大量神经元变性坏死,核固缩,胶质细胞增生,海马出现大量空泡化。电子显微镜观察,可见高尔基复合体肿胀、溶解,内质网扩张成池以及细胞间质严重水肿。低剂量组HE染色,皮层少量神经元变性坏死,核固缩；海马出现少量空泡化。电子显微镜可以观测到神经元核形态不规则、核结构不清,胞体固缩以及线粒体变性。对照组病理检查未见明显异常。1H-MRS检测：与对照组比较,高剂量组NAA/Cr降低,Cho/Cr、mI/Cr显著升高(P0.05),可见明显乳酸峰。低剂量组NAA/Cr降低,Cho/Cr、mI/Cr升高(P0.05),未见明显乳酸峰,峰值低于高剂量组。高、低剂量组间差异无显著性(P0.05)。高、低剂量组对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论：本次实验利用氯化甲基汞染毒法,成功制备了早期慢性暴露氯化甲基汞损伤子代大鼠脑海马动物模型,实验组仔鼠的早期生理发育指标无异常。1H-MRS显示高、低剂量组NAA/Cr降低,表明海马区神经元活性降低,神经元形态萎缩、变性、丢失。CHO/Cr升高,提示细胞膜受损、神经胶质细胞增殖加速。mI/cr升高反映了神经胶质细胞增殖活跃。出现双乳酸峰,提示线粒体受损。光学显微镜及电镜证实：实验组脑皮层及海马明显受损。发育期氯化甲基汞慢性暴露至成年后,Morris水迷宫实验证实高剂量组造成大鼠认知功能的损害仍不能恢复,低量组认知功能损害不明显。1H-MRS检查结果提示两组大鼠的脑海马代谢产物均有改变,其结果亦得到HE病理、电镜检查结果证实,说明1H-MRS检查比水迷宫试验更为敏感。本研究结果表明1H-MRS可以反应活体脑海马损伤情况,指标敏感,与病理改变有高度相关性。为氯化甲基汞脑海马损伤的早期临床诊断,病情分析,早期治疗提供了理论依据。
【关键词】：氯化甲基汞 质子磁共振波谱 海马 认知功能障碍
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 论文创新点5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 主要缩略词一览表14-15
• 研究背景15-17
• 第一部分 氯化甲基汞慢性暴露对子代大鼠脑海马的影响17-32
• 2 材料与方法17-23
• 3 结果23-32
• 第二部分 氯化甲基汞慢性暴露对成年大鼠脑海马的影响32-45
• 4 对象与方法32-37
• 5 结果37-45
• 讨论45-56
• 实验结论56-57
• 本次试验的局限性57-58
• 参考文献58-68
• 综述68-83
• 参考文献77-83
• 博士在读期间发表论文83-85
• 致谢85

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本文编号：515869