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microRNA-34a调控血管平滑肌细胞表型转化在血管损伤修复及重塑中的作用及机制

发布时间:2017-07-04 20:22

  本文关键词:microRNA-34a调控血管平滑肌细胞表型转化在血管损伤修复及重塑中的作用及机制


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【摘要】:研究背景及目标:以动脉粥样硬化为基本组织病理改变的血管病变发生发展导致血管重塑和管腔狭窄过程中,血管稳态的破坏、损伤修复失衡是最基本的特征。血管平滑肌细胞通过干/祖细胞分化及本身表型转化参与血管损伤修复及病理性重塑。我们课题组既往研究已经发现microRNA-34a(miR-34a)可促进胚胎干细胞分化为血管平滑肌细胞,然而对miR-34a是否调控成熟血管平滑肌细胞功能和血管病理重塑仍然知之甚少。本研究希望阐述miR-34a对血管平滑肌细胞表型转化后增殖迁移功能以及血管损伤后新生内膜形成的作用,并鉴定miR-34a靶基因,阐明其作用机制。研究方法:本研究分离小鼠原代血管平滑肌细胞体外培养,利用体外平滑肌细胞表型转化模型,观察miR-34a表达变化,并过表达或抑制miR-34a,研究miR-34a对血管平滑肌细胞增殖、迁移能力的影响。其次,利用生物信息学分析、分子克隆等方法鉴定miR-34a的功能性靶基因。最后,建立小鼠股动脉导丝损伤内膜病理性增生模型,在损伤血管局部过表达miR-34a,研究miR-34a对血管损伤后内膜新生的作用。结果:原代血管平滑肌细胞经历血清饥饿,FBS、PDGF-BB、ox-LDL刺激后表型由“收缩型”向“增殖迁移型”转化,在此过程中miR-34a表达显著下降。功能研究中,细胞计数和BrdU实验发现过表达miR-34a抑制FBS、PDGF-BB诱导的平滑肌细胞增殖,划痕实验和Transwell实验则表明过表达miR-34a减弱平滑肌细胞迁移能力,反之抑制miR-34a表达可增加平滑肌细胞增殖、迁移能力。多个miRNA的生物信息学分析数据库和RNA结构分析软件预测Notchl是miR-34a的靶基因。平滑肌细胞中过表达miR-34a在mRNA和蛋白水平下调Notch1表达,而抑制miR-34a则Notchl表达升高。分子克隆和荧光素酶报告实验表明,miR-34a高表达能显著降低Notchl 3'UTR调控的荧光素酶活性,而对Notchl 3'UTR中miR-34a结合位点进行突变后,miR-34a对荧光素酶活性的抑制作用被消除。miR-34a和Notchl过表达质粒共转染,发现miR-34a抑制平滑肌细胞增殖、迁移,而同时高表达Notch1可消除miR-34a的作用。成功建立小鼠股动脉导丝损伤内膜增生模型,发现miR-34a在血管损伤后内膜增生过程中显著下降,损伤血管局部高表达miR-34a可明显减轻血管损伤后内膜新生。此外,miR-34a高表达减弱Notchl在血管中表达,减少血管新生内膜中PCNA阳性细胞比例,从体内实验层面验证了miR-34a下调Notchl抑制平滑肌细胞增殖。结论:本研究成功揭示了miR-34a在血管平滑肌细胞中的新功能。miR-34a抑制血管平滑肌细胞表型转化后的增殖及迁移能力。Notch1是miR-34a的功能性靶基因,miR-34a直接结合Notch1 mRNA的3’UTR,下调Notch1表达,并通过调控Notch1影响平滑肌细胞功能。在血管损伤内膜病理性增生过程中,miR-34a过表达显著减轻新生内膜。miR-34a可能是防治平滑肌细胞相关血管疾病的新靶点。
【关键词】:microRNA-34a 血管平滑肌细胞 表型转化 内膜新生 血管疾病
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R54
【目录】:
  • 致谢5-7
  • 前言7-9
  • 中文摘要9-11
  • 英文摘要11-14
  • 缩略词表14-22
  • 引言22-24
  • 第一部分 miR-34a调控血管平滑肌细胞功能24-53
  • 1. 材料24-27
  • 1.1 小鼠24
  • 1.2 细胞培养相关试剂24
  • 1.3 其他试剂及缓冲液24-25
  • 1.4 常用仪器及耗材25-26
  • 1.5 所用分析软件26-27
  • 2. 方法27-36
  • 2.1 小鼠血管平滑肌细胞原代培养27-28
  • 2.2 血管平滑肌细胞传代培养28
  • 2.3 血管平滑肌细胞体外表型转化研究模型28-29
  • 2.4 平滑肌细胞miRNA模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)转染29-30
  • 2.5 细胞中总RNA提取30
  • 2.6 miRNA cDNA合成与实时定量PCR(RT-qPCR)30-32
  • 2.7 平滑肌细胞增殖实验32-33
  • 2.8 平滑肌细胞迁移实验33-34
  • 2.9 平滑肌细胞凋亡实验34-35
  • 2.10 统计分析35-36
  • 3. 结果36-51
  • 3.1 成功分离血管平滑肌细胞并体外培养36-38
  • 3.2 miR-34a在多种病理生理因素刺激下的血管平滑肌细胞中显著下降38-39
  • 3.3 血管平滑肌细胞中成功高表达和抑制miR-34a39-40
  • 3.4 miR-34a抑制血管平滑肌细胞增殖40-42
  • 3.5 miR-34a抑制血管平滑肌细胞迁移42-48
  • 3.6 miR-34a不影响血管平滑肌细胞凋亡48-51
  • 4. 讨论51-53
  • 第二部分 miR-34a调控Notch1表达影响平滑肌细胞功能53-80
  • 1. 材料53-56
  • 1.1 细胞培养试剂53
  • 1.2 分子生物学常用试剂及缓冲液53-55
  • 1.3 常用仪器及耗材55
  • 1.4 统计及分析软件55-56
  • 2. 方法56-67
  • 2.1 预测并筛选miR-34a靶基因56
  • 2.2 靶基因Notchl 3'UTR荧光素酶报告基因构建56-61
  • 2.3 靶基因Notchl 3'UTR 上 miR-34a结合位点突变61-63
  • 2.4 荧光素酶报告实验和β-gal活性检测63
  • 2.5 Western Blot蛋白检测63-65
  • 2.6 平滑肌细胞miR-34a模拟物和Notch1质粒共转染65-66
  • 2.7 平滑肌细胞功能实验66
  • 2.8 统计分析方法66-67
  • 3. 结果67-78
  • 3.1 生物信息学分析显示Notch1是miR-34a的靶基因67-68
  • 3.2 miR-34a在mRNA和蛋白水平调控Notch1表达68-69
  • 3.3 miR-34a通过直接结合Notchl 3'UTR上的结合位点下调Notch1表达69-71
  • 3.4 Notch1介导miR-34a调控血管平滑肌细胞增殖及迁移功能71-78
  • 4. 讨论78-80
  • 第三部分 miR-34a对小鼠股动脉损伤内膜增生的影响80-96
  • 1. 材料80-82
  • 1.1 小鼠80
  • 1.2 动物实验手术器械80
  • 1.3 常用试剂及缓冲液80-81
  • 1.4 常用仪器及耗材81
  • 1.5 统计分析软件81-82
  • 2. 方法82-86
  • 2.1 小鼠股动脉导丝损伤内膜增生模型82
  • 2.2 小鼠在体miR-34a过表达干预导丝损伤血管82-83
  • 2.3 小鼠血管组织RNA提取及检测83
  • 2.4 小鼠血管取材及石蜡包埋切片83-84
  • 2.5 血管石蜡切片HE染色分析84
  • 2.6 血管石蜡切片免疫染色84-85
  • 2.7 统计分析85-86
  • 3. 结果86-94
  • 3.1 成功建立小鼠股动脉导丝损伤内膜病理性增生模型86-87
  • 3.2 血管损伤后miR-34a表达显著降低87-89
  • 3.3 在体miR-34a高表达减轻血管损伤后内膜病理性增生89-91
  • 3.4 miR-34a通过下调Notch1表达减轻血管损伤后内膜病理性增生91-94
  • 4. 讨论94-96
  • 总结与展望96-98
  • 结论98-99
  • 参考文献99-110
  • 综述110-160
  • 参考文献132-160
  • 作者简历及在学期间所取得的科研成果160-162


本文编号:519224

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