氧化应激反应在牙周炎发病中的意义

发布时间：2017-07-05 18:15

  本文关键词：氧化应激反应在牙周炎发病中的意义

  更多相关文章： 氧化应激 活性氧(ROS) 牙周膜细胞 过氧化氢 牙周炎

【摘要】：活性氧(ROS)参与多种疾病的病理过程,并且在正常代谢反应中起到重要作用。ROS参与包括艾滋病、癌症、动脉粥样硬化、慢性炎性状态和老化过程等一系列疾病状态。氧分子作为氧化磷酸化的终末电子受体,在需氧代谢中占有重要地位,但这种对电子需求的同时也导致了各种活氧的形成,如O-·2、·OH及具有氢抽提能力的H2O2、HClO等。ROS可启动一个链式反应,易与细胞膜上的各种不饱和脂肪酸及胆固醇反应,这种直接作用于细胞的氧化损伤能导致细胞凋亡。但生物体在进化的过程中具备有效的抗ROS防御体系,如超氧化物歧化(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及抗氧化物质(如维生素C、维生素E)等,因此,机体代谢耗氧的同时常伴有ROS的形成,细胞的功能状态取决于ROS与抗氧化能力的平衡。牙周病是人类发病最高的感染性疾病,以细菌为始动因子,破坏牙周支持组织,是成人失牙的最主要的原因。一些研究认为牙周病患者唾液和龈沟液的氧化/抗氧化活性的平衡被打破,这些患者的牙周膜更易受ROS的损伤作用。研究发现牙周病患者的唾液总抗氧化物活性水平与正常人相比没有改变或者下降。氧化物/抗氧化物水平的失衡和铁铜(促进高活性·OH种类的产生)来源的改变促进牙周组织的损伤,在ROS的作用下牙周膜细胞、牙龈上皮细胞发生潜在的细胞损伤和细胞溶解。SOD主要在局限在牙周膜发挥作用,其次是胶原纤维,成纤维细胞。随着牙周病严重程度增加,SOD和过氧化氢活性在牙龈组织中有所下降。本研究通过临床采集健康人群牙周膜组织,原代培养牙周膜细胞,因正畸拔牙的患者,年龄12-15岁。所选牙无龋坏、根尖周炎和牙周炎。牙离体后立即投入细胞培养液转送,然后在超净台内用加入抗生素的PBS反复冲洗根面,去净血污。再用手术刀刮取根中三分之一的牙周膜,用细胞培养液洗两次,用剪刀反复剪碎后移入离心管,采用酶消化法处理,加入0.1%胶原酶3ml,37℃振荡消化50～60min,见组织松散,加1%胰蛋白酶调至0.125%,继续消化25min,见大部分细胞游离,用吸管充分吹打使其充分分散,加入少量10%FBS PMI1640培养液终止消化。1000rpm离心10min,弃上清,加入10%FBS PMI1640培养液使细胞再悬,然后接种于培养瓶中,加入适量培养液,置37℃、95%空气、5%CO2和饱和湿度的孵箱中。隔日观察细胞生长情况,2～3天更换培养液。同时,采用组织块法,用组织剪将组织块剪成1mm×1mm×1mm左右大小的小块,接种于细胞培养瓶中,均匀铺开,每块间距5mm左右。放置好后,将培养瓶轻轻翻转,加入适量的含10%FBS的DMEM,放入CO2孵箱中。4h后翻瓶。培养20—25天,细胞从组织块中游出铺满瓶底90%左右后,0.25%胰酶消化传代。至第3代时细胞用液氮冻存备用。第5代到第8代的细胞用于后续实验。收集对数期PDLC细胞,调整细胞悬液浓度接种于96孔板,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000/孔,边缘孔用无菌PBS填充。5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底,待细胞贴壁完全状态良好时,在特定时间(0h-48h)加入不同浓度的药物(VC)或化合物(H2O2)处理细胞,染色后的PDLCs用FACScan流式细胞仪检测分析。将PDLC细胞接种至12孔细胞板,用不同剂量的H2O2和VC处理PDLCs3h和6h后,每孔加入约160ul NP-40细胞裂解液,冰上裂解细胞30min,反复吹打或置振荡器上震荡5min,吸取细胞裂解液入预冷的Ep管中,4℃ 12000rpm离心10mmin,上清转移至另一EP管中,用BCA试剂盒检测蛋白浓度。结果：MTT检测不同浓度H2O2处理下细胞活性,600μM H2O2处理3h后PDLCs活力显著降低。约50%的PDLCs在600 μM H2O2处理后死亡,并且随着H2O2浓度升高死亡数相对稳定。MTT检测不同浓度H2O2处理下细胞活性。结果显示600μM H2O2处理3h后PDLCs活力显著降低。约50%的PDLCs在600pμM H2O2处理后死亡,并且随着H2O2浓度升高死亡数相对稳定。同时延长相同浓度H2O2处理时间到6h,也得到类似的结果。用高浓度如800μM和1000μM H2O2处理细胞,细胞的正常形态消失,特别在1000μM浓度下,细胞变圆。在刺激6h后观察细胞形态发现毒力作用最明显。研究中还发现会随着H2O2浓度升高,细胞的部分皱缩和完整结构消失的现象增加。总的来说,H2O2可时间和剂量依赖性地引起PDLCs细胞死亡。用不同剂量VC处理PDLCs,MTT方法检测处理后细胞活力,结果除了最低浓度10 μM的VC处理外,其它相对高剂量(从50～200μM)的VC在没有H2O2处理时也会对细胞产生毒性作用。因此,本研究认为,ROS对PDLC具有毒性作用,H2O2能通过激活caspase-3和caspase-9诱导凋亡信号通路,改变PDLC的形态及活性,VC可拮抗H2O2的促凋亡作用,适当的VC处理可能是一种潜在治疗牙周炎的有效手段。多项研究证实ROS在许多病理变化中均发挥着作用,其中包括慢性牙周炎。蛋白羰基化是蛋白氧化损伤时的生物标志状态,反映ROS诱导的细胞损伤。本研究对13名牙周炎患者和13名正常对照检测血浆中蛋白羰基(PC)水平。对所有受试对象进行详细的口腔检查和取样,试剂盒检测血浆中蛋白羰基的水平。结果：与正常人相比,慢性牙周炎患者外周血蛋白羰基水平明显升高(P0.05)。检测患者血浆中PC水平及PC浓度,结果显示慢性牙周炎组PC水平为2.30(0.94-3.17)nmol/mg,牙周健康组PC水平为1.42 (0.78-2.32) nmol/mg,慢性牙周炎组PC水平明显高于牙周健康组(P0.01)。慢性牙周炎组PC浓度为184.6(84.6-269.4) nmol/ml,牙周健康组为115.5 (49.3-165.3) nmol/ml,慢性牙周炎组PC浓度也明显高于牙周健康组(P0.01)血浆PC水平与牙周参数PD的相关系数是0.592,血浆PC水平与CAL的相关系数是0.673,而血浆PC浓度与牙周参数PD的相关系数是0.657,与CAL的相关系数是0.55。由此可见,PD和CAL与血浆PC水平及总量之间均呈明显正相关。结论：慢性牙周炎患者循环系统中蛋白羰基化水平升高,PC水平的升高可能是牙周炎氧化损伤的标志,预示牙周炎症状态。
【关键词】：氧化应激 活性氧(ROS) 牙周膜细胞 过氧化氢 牙周炎
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.42
【目录】：

• 前言5-8
• 1. 缩略词表8-9
• 2. 中文摘要9-12
• 3. 英文摘要12-17
• 4. 第一部分17-39
• 综述一 性氧在牙周病中的潜在发病机制(文献综述)17-30
• 参考文献24-30
• 综述二 牙周炎的病毒感染损伤机制（文献综述）30-39
• 参考文献36-39
• 5. 第二部分 人牙周膜细胞的体外原代培养和鉴定39-50
• 6. 第三部分 活性氧对牙周膜细胞的损伤和凋亡的影响50-70
• 7. 第四部分 慢性牙周炎患者血浆蛋白羰基化水平的意义70-84
• 8. 全文结论84-85
• 9. The Effect of Vitamin C Administration on Hydrogen Peroxide InducedCytotoxicity in Periodontal Ligament Cells85-102
• 10. 攻读学位期间发表论文情况102-103
• 11. 致谢103-104

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本文编号：523030