miR-221对正常乳腺和乳腺肿瘤干细胞调控的研究

发布时间：2017-07-08 06:01

  本文关键词：miR-221对正常乳腺和乳腺肿瘤干细胞调控的研究

  更多相关文章： 乳腺肿瘤 干细胞 miR-221 ATXN1 RNA干扰 多能性 PIM2 中胚层

【摘要】：正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中存在具有干细胞特性的细胞,乳腺干细胞可以自我更新维持干性,也可以分化产生表型、功能不同的乳腺细胞。乳腺肿瘤干细胞具有自我更新的能力,并分化产生非肿瘤干细胞以维持肿瘤群体中细胞的类型和数目。许多报道发现表观调控对干细胞的调控有重要的作用。本研究中我们发现miR-221在乳腺干细胞和肌上皮细胞中的表达量高于其他分化的细胞,在乳腺肿瘤干细胞中的表达量高于非肿瘤干细胞的表达量。在正常的乳腺细胞中过表达miR-221可产生更多的肌上皮细胞,降低miR-221的表达可产生更多的腺腔细胞。在Luminal型乳腺癌细胞中过表达miR-221可促进乳腺肿瘤干细胞的扩增并使肿瘤恶性程度增加。同时miR-221的表达量与病人的存活率呈反相关。在正常乳腺细胞和乳腺肿瘤细胞中过表达miR-221后可诱导肿瘤干细胞相关的EMT。EMT相关的基因ATXN1是miR-221的靶基因,miR-221通过调控ATXN1调节正常乳腺干细胞和乳腺肿瘤干细胞的自我更新。我们的研究表明miR-221通过靶向ATXN1不仅可调控正常乳腺干细胞还可以调控乳腺肿瘤干细胞的自我更新和分化。人胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)是具有自我更新和分化潜能的细胞。研究其自我更新和分化的调控机理对再生医学和发育生物学的研究具有重要意义。我们首先根据基因芯片找出在hES中高表达的基因和通过siRNA和指示OCT4表达的绿色荧光蛋白报告系统在全基因范围内筛选到的可降低OCT4表达的基因,从中我们选出129个基因用于后续的筛选,比如TAF6, PRMT5, PHC1等。通过esiRNA或shRNA降低基因在细胞中的表达,检测其对hES自我更新和多能性的影响,我们发现有些基因敲低后可以引起hES的分化,有些可以调控hES的多能性。我们选择PIM2作为研究对象。我们发现PIM2敲低后对hES的标志基因几乎没有影响。拟胚胎(embryoid body, EB)实验发现,降低PIM2的表达后中胚层标志基因的表达量升高,外胚层和内胚层的标志基因的表达量降低,说明PIM2可促进hES向中胚层的分化。畸胎瘤实验发现降低PIM2的hES长出的畸胎瘤中大部分都是中胚层形成的组织,比如软骨组织。进一步说明了PIM2可调控hES的多能性。
【关键词】：乳腺肿瘤 干细胞 miR-221 ATXN1 RNA干扰 多能性 PIM2 中胚层
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 第一部分 miR-221对正常乳腺和乳腺肿瘤干细胞调控的研究8-82
• 中文摘要10-11
• Abstract11-12
• 第一章 绪论12-37
• 1.1 乳腺干细胞12-15
• 1.1.1 乳腺干细胞的研究方法14-15
• 1.2 肿瘤干细胞15-37
• 1.2.1 乳腺癌的治疗现状15-17
• 1.2.2 乳腺肿瘤干细胞17-19
• 1.2.3 乳腺肿瘤干细胞的研究方法19-20
• 1.2.4 EMT与肿瘤干细胞20-23
• 1.2.5 信号通路与肿瘤干细胞23-28
• 1.2.6 microRNA与肿瘤干细胞28-32
• 1.2.7 lncRNA与肿瘤干细胞32-33
• 1.2.8 表观调控蛋白与肿瘤干细胞33-37
• 第二章 材料和方法37-49
• 2.1 实验相关药品和试剂37-38
• 2.2 载体构建38-40
• 2.2.1 miR-221过表达载体构建38
• 2.2.2 miR-221 shRNA载体构建38-39
• 2.2.3 ATXN1 shRNA载体构建39-40
• 2.2.4 荧光素酶基因报告载体构建40
• 2.3 病毒包装和感染40
• 2.4 细胞培养40-41
• 2.5 实时定量PCR(Q-PCR)41-43
• 2.5.1 RNA提取41-42
• 2.5.2 RNA反转录42-43
• 2.5.3 Q-PCR43
• 2.6 免疫组化和组织切片免疫荧光43-45
• 2.7 正常乳腺细胞微球培养和消化45-46
• 2.8 ALDEFLUOR分析和分选46
• 2.9 细胞表面标记物的流式分析和分选46-47
• 2.10 基因芯片47-48
• 2.11 荧光素酶报告技术48
• 2.12 小鼠成瘤实验48-49
• 第三章 结果分析与讨论49-68
• 3.1 miR-221在乳腺干细胞中高表达49-51
• 3.2 miR-221调节乳腺干细胞的分化51-55
• 3.3 miR-221的表达量与乳腺癌的恶性程度呈正相关55-57
• 3.4 miR-221调控乳腺肿瘤干细胞57-60
• 3.5 miR-221调控EMT过程60-63
• 3.6 miR-221调控乳腺干细胞和乳腺干细胞通过抑制ATXN163-68
• 参考文献68-82
• 第二部分 PIM2调控人胚胎干细胞的多能性82-110
• 中文摘要84-85
• Abstract85-86
• 第一章 研究背景86-91
• 1.1 胚胎干细胞86
• 1.2 胚胎干细胞的调控86-91
• 第二章 材料和方法91-99
• 2.1 实验相关药品和试剂91
• 2.2 载体构建91-94
• 2.3 esiRNA制备94-96
• 2.4 病毒包装和感染96
• 2.5 细胞培养96
• 2.6 实时定量PCR(Q-PCR)96-98
• 2.6.1 RNA提取96-97
• 2.6.2 RNA反转录97-98
• 2.7 拟胚体(embryoid body,EB)实验98
• 2.8 畸胎瘤实验98-99
• 第三章 实验结果99-106
• 3.1 基因筛选99
• 3.2 shRNA或esiRNA效果99-101
• 3.3 PIM2在胚胎干细胞和分化细胞中的表达量101-102
• 3.4 PIM2对胚胎干细胞自我更新的影响102-103
• 3.5 PIM2调控胚胎干细胞的多能性103-104
• 3.6 PIM2对诱导性多能干细胞的影响104-106
• 参考文献106-110
• 附录110-112
• 致谢112-113
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果113

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本文编号：533215