1、NF-κB抑制剂倍半萜内酯对糖尿病小鼠肾组织胰岛素抵抗改善的分子机制初探 2、碘海醇清除率在慢性肾脏病儿童肾功能评价

发布时间：2017-07-08 14:20

  本文关键词：1、NF-κB抑制剂倍半萜内酯对糖尿病小鼠肾组织胰岛素抵抗改善的分子机制初探 2、碘海醇清除率在慢性肾脏病儿童肾功能评价方面的应用研究

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【摘要】：研究背景：糖尿病肾病(DN)是糖尿病的严重并发症,目前仍以较晚期的降压、降糖治疗为主,缺乏针对其早期发病机制的深入研究及干预措施。目前针对糖尿病肾病发病机制的研究主要集中在多元醇及蛋白激酶C通路激活,糖基化终末产物累积以及炎症信号通路活化等方面。而这些因素与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)密不可分。但目前关于IR在糖尿病肾病中的具体表现形式及针对IR干预措施的研究相对较少。AS160是一种Rab-GTP酶活化蛋白,可以调控包括葡萄糖转运体在内的多种物质转运蛋白的胞内转位过程。在肾脏,AS160被发现可以调控钠、水通道蛋白的转运,但对于肾脏糖转运蛋白的调控未见报道。葡萄糖转运体4(GLUT4)是介导胰岛素刺激的糖摄取的主要糖转运体,是胰岛素信号通路的重要效应器,与IR密切相关。在经典胰岛素敏感组织如骨骼肌和脂肪细胞中,AS160被发现是糖代谢胰岛素信号通路中GLUT4的上游分子,其磷酸化形式可促进GLUT4囊泡的转运过程,与GLUT4的功能密不可分。研究已表明,条件性敲除骨骼肌或脂肪细胞GLUT4及AS160可导致全身和局部组织的IR。近端肾小管上皮细胞钠葡萄糖转运体1(SGLT1)和钠葡萄糖转运体2(SGLT2)通过重吸收葡萄糖对维持机体糖稳态有重要作用,已成为新型降糖药物的靶点。因此,针对糖尿病肾组织中AS160与糖转运体GLUT4及SGLT1/SGLT2的研究有助于探索肾脏IR的分子机制,以期为早期干预糖尿病肾损害和改善DN预后提供可能的分子靶点。我们前期研究结果显示,NF-KB抑制剂倍半萜内酯(PTN)可以改善糖尿病小鼠全身IR及肾脏病理损伤,其是否对肾脏IR有作用及可能的机制尚未见报道。研究目的：在db/db糖尿病肾病小鼠基础上研究糖尿病肾组织是否存在AS160与糖转运体GLUT4及SGLT1/SGLT2导致的胰岛素抵抗。了解NF-KB抑制剂PTN是否可以改善糖尿病肾组织IR,进而延缓DN进展。研究方法：建立db/db糖尿病肾病小鼠模型并设立PTN干预组。将小鼠分为三组：对照组(db/m+NS)、糖尿病肾病组(db/db+NS)、PTN干预组(db/db+PTN)。所有小鼠在8周龄开始进入实验,分别在处理的T0(8周龄)、T4(12周龄)T8(16周龄)及T12(20周龄)留取血清、尿液及肾组织标本。利用实时定量PCR、免疫组化／荧光、免疫印迹(WB)等方法检测小鼠AS160、p-AS160 (Thr642) 及糖转运体GLUT4、SGLT1/SGLT2在糖尿病肾组织中的表达情况；对AS160/p-AS160与GLUT4、SGLT1/SGLT2进行共定位,初步探索AS160对肾脏糖转运体的调控情况,了解AS160在糖尿病肾组织胰岛素抵抗中的作用。研究结果：(1)db/db小鼠糖尿病肾病模型建立成功。自8周龄起,db/db小鼠体重即高于db/m小鼠。随着周龄增加,db/db小鼠表现出尿蛋白增加,高血脂、高血糖、高胰岛素血症,以及肾小球肥大、系膜基质增多等生化和肾脏病理改变。(2)免疫组化和免疫荧光显示AS160在肾脏有表达,主要表达在肾脏皮质和髓质的肾小管中,在肾小球的鲍曼氏囊上皮细胞侧可见较弱的表达。AS160蛋白在db/m小鼠肾脏的表达不随周龄增加而改变。而在db/db、鼠,AS160蛋白表达较db/m小鼠轻度增加。给予PTN干预后,两组并无明显差别。免疫组化测定db/db小鼠AS160蛋白水平表达：8w 1.22±0.26,12w 1.27±0.38,16w 1.35±0.25,20w1.22±0.30。给予PTN干预0周、4周、8周及12周后AS160蛋白表达为T0(8w)1.17±0.22,T4(12w)1.22±0.31,T8(16w)1.24±0.39,T12(20w)1.03±0.35。(3)免疫荧光显示p-AS160 (phospho T642)主要分布在肾皮质小管的管腔侧,在髓质肾小管的表达较弱,而在肾小球未见阳性表达。肾脏中p-AS160蛋白表达在db/db小鼠早期(8w)高于db/m小鼠,但随着周龄的增加,其表达呈下降趋势。给予db/db小鼠PTN干预后,p-AS160的下降趋势有所改善。免疫组化显示db/db小鼠肾脏p-AS160表达为：8w 1.55±0.30,12w 1.18±0.22,16w 1.06±0.20,20w0.98±0.18。给予PTN干预0周、4周、8周及12周后p-AS160表达为TO(8w)1.54±0.32,T4(12w)1.42±0.26,T8(16w)1.41±0.21,T12(20w)1.34±0.08。(4)免疫组化和免疫荧光结果显示GLUT4同样以肾小管为主要表达部位,皮质和髓质肾小管均有表达,肾小球未见阳性表达。GLUT4在db/m小鼠肾脏表达不随周龄增加而改变；但在db/db小鼠,GLUT4无论是在mRNA水平还是在蛋白水平,均表现出早期(8周龄)升高,随着周龄的增加,表达逐渐降低的趋势。而PTN可以增加DN小鼠肾脏GLUT4的表达。GLUT4 mRNA与GLUT4蛋白在不同周龄db/db小鼠肾脏表达情况分别为：GLUT4mRNA水平8w 1.79±0.25,12w 1.32±0.33,16w 0.98±0.23,20w 1.00±0.12；GLUT4蛋白水平8w 1.32±0.28,12w 1.05±0.47,16w 0.85±0.10,20w 0.88±0.25。PTN干预db/db小鼠0周(TO)、4周(T4)、8周(T8)及12周(T12)后GLUT4蛋白表达分别为T0(8w)1.31±0.21,T4(12w)1.20±0.39,T8(16w)1.42±0.43,T12(20w)1.53±0.15。(5)免疫荧光共染显示AS160及p-AS160 ((phospho T642)均与部分GLUT4在肾小管上皮细胞有共表达。虽然SGLT1/SGLT2主要表达在近端肾小管管腔侧,但p-AS160与SGLT1仅有少量的共表达,与SGLT2在肾小管上皮细胞无共表达。研究结论：(1)db/db糖尿病肾病小鼠模型具有全身胰岛素抵抗的特点,并伴有糖尿病肾病病理改变。给予PTN干预后可改善其全身全身胰岛素抵抗情况及肾脏病理变化。(2)AS160及其功能形式p-AS160在肾脏有表达,以肾小管为主要表达部位。随着DN小鼠周龄增加,p-AS160糖尿病肾组织的表达逐渐降低。(3)GLUT4在小鼠肾脏主要表达肾小管中,其在db/db小鼠肾脏表达呈降低趋势。部分GLUT4与AS160及P-AS160在肾小管上皮细胞有共表达,提示肾脏可能存在AS160调控GLUT4转运的物质基础。(4)给予PTN干预后,糖尿病肾组织p-AS160与GLUT4表达增加,提示PTN可能通过增加糖转运,改善糖尿病肾组织糖代谢及胰岛素敏感性。(5) SGLT1/SGLT21与p-AS160(Thr 642)无明显共表达,考虑AS160并不参与SGLT1/SGLT2的转运调控或不是其主要调控蛋白。研究目的：准确评价儿童肾功能对儿童肾脏疾病早期诊断、早期治疗具有重要意义。中国成人估算肾小球滤过率公式(eGFR)在临床上的应用相对成熟，而国外儿童GFR估算公式在我国儿童人群中的应用并未得到验证。目前我国关于儿童GFR测定方法的研究较少，我国仍缺乏一种准确评价儿童肾功能的方法。碘海醇血浆清除率已被证实是测定肾小球滤过率(GFR)的可靠方法，然而该方法在中国尚未被广泛应用及推广。本课题前期工作己建立利用高效液相色谱法(HPLC)测定血清碘海醇浓度的方法，该方法稳定可靠。本研究拟在慢性肾脏病儿童中以99m7c-DTPA血浆清除率为参照评价碘海醇清除率评估儿童肾小球滤过率的准确性；评估单次采血法和干血滤纸片法在碘海醇清除率应用中的可行性。研究方法：设定HPLC色谱条件，建立碘海醇血清浓度测定的标准曲线，对标准曲线的线性、方法的精密度、真实性进行验证。纳入慢性肾脏病儿童33例(前期工作已纳入12例，总共45例)，同时进行99mc-DTPA清除率与碘海醇血浆清除率测定，即分别在99mTc-DTPA和碘海醇注射后2h和4h以及2h和5h进行两次采血测量99mTc-DTPA和碘海醇血浆清除率。评价两种方法测得的肾小球滤过率的相关性和一致性。对碘海醇单次采血法(2h)与碘海醇双次采血法(2h和5h)进行比较，评价单次采血的可行性。对13例患儿同时采用干血滤纸片法测定碘海醇清除率，并与碘海醇双次采血法进行比较，评价干血斑滤纸片碘海醇清除率可行性。研究结果：(1)本研究建立的HPLC法侧定碘海醇浓度在10～1000mg/L范围内线性良好(R2=0.9998)，该方法的精密度、真实性较好(批间误差与批内误差RSD%5%,平均回收率R%96%)。(2)45例患儿均完成碘海醇血浆清除率测定。其中36例患儿同时完成99mTc-DTPA血浆清除率测定，13例患儿完成干血滤纸片碘海醇清除率测定。(3)碘海醇血浆清除率与99mTc-DTPA血浆清除率比较，两者有很好的相关性(r=0.941,P0.01)，，两者结果的差值较小，为(6.53±11.6)ml/(min. 1.73m2)。(4)单次采血与双次采血测得的碘海醇清除率相关性为r=0.958,差值为(4.26±9.06)ml/(min. 1.73m2)。(5)干血滤纸片碘海醇清除率与血清碘海醇清除率比较,两者相关性为r＝0.95,差值为(0.48±10.89)ml/(min. 1.73m2)。研究结论：碘海醇血浆清除率与99mTc-DTPA血浆清除率之间的相关性及一致性较好，是一种理想的评估肾功能的方法。单次采血法与千血滤纸片法使碘海醇清除率测定更简便、可行。
【关键词】：糖尿病肾病 胰岛素抵抗 GLUT4 AS160 倍半萜内酯 碘海醇清除率 儿童 慢性肾脏病 肾小球滤过率
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 课题1 NF-κB抑制剂倍半萜内酯对糖尿病小鼠肾组织胰岛素抵抗改善的分子机制初探7-65
• 中文摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-14
• 1 实验材料和方法14-26
• 2 实验结果26-46
• 2.1 db/db糖尿病肾病小鼠动物模型的建立26-28
• 2.2 db/db小鼠肾脏AS 160分布、表达变化及PTN对其影响28-31
• 2.3 db/db小鼠肾脏p-AS160(phospho Thr642)表达变化及PTN对其影响31-37
• 2.4 db/db小鼠肾脏GLUT4表达变化及PTN对其影响37-42
• 2.5 小鼠肾脏AS160/p-AS160与肾脏糖转运体关系的研究42-46
• 3 讨论46-48
• 4 结论48-49
• 5 参考文献49-52
• 文献综述 AS160与GLUT4在胰岛素抵抗、糖尿病肾病中的作用52-65
• 参考文献59-65
• 课题2 碘海醇清除率在慢性肾脏病儿童肾功能评价方面的应用研究65-99
• 英文缩略词表66-67
• 中文摘要67-68
• Abstract68-70
• 前言70-71
• 1 实验材料和方法71-73
• 2 实验结果73-79
• 2.1 HPLC方法测定血清碘海醇浓度标准曲线建立73-74
• 2.2 患儿一般资料74
• 2.3 ~(99m)Tc-DTPA血浆清除率与碘海醇血浆清除率比较74-76
• 2.4 碘海醇单次取血与碘海醇双次取血血浆清除率比较76-77
• 2.5 干血滤纸片与血清碘海醇清除率比较77-79
• 2.6 碘海醇清除率安全性79
• 3 讨论79-82
• 4 结论82
• 5 参考文献82-85
• 文献综述 碘海醇清除率在慢性肾脏病儿童肾功能评价方面的应用研究85-99
• 参考文献94-99
• 致谢99-100
• 个人简历100

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