蝉翼藤抗风湿活性物质基础及作用机制研究

发布时间：2017-07-14 06:03

  本文关键词：蝉翼藤抗风湿活性物质基础及作用机制研究

  更多相关文章： 蝉翼藤 山酮 类风湿性关节炎 物质基础 作用机制

【摘要】：蝉翼藤是我国南方地区广泛使用的一味传统植物药,主要用于治疗骨折、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)及各种炎症。在漫长的使用历史中,虽然蝉翼藤的有效性及安全性得到了充分的验证,但现代研究非常匮乏。为推进该品种的现代化开发,获取新型抗风湿有效药物,对蝉翼藤抗风湿活性物质基础及相关作用机制开展研究非常必要。目的：在充分论证蝉翼藤抗风湿作用的有效性和可靠性的前提下,对不同极性萃取部位进行体内外抗风湿活性的筛选及验证,并对有效部位进行成分研究,获取潜在的活性单体化合物。利用体外细胞模型,初步阐明活性成分抗风湿作用的部分分子机制。方法：1.采用佐剂性关节炎(AA)小鼠模型研究蝉翼藤水提物和醇提物对实验性关节炎的治疗作用。关节炎的临床表现及严重程度采用多种指标综合评估,主要包括炎症受累足足重、病理切片解剖学特征和免疫器官肿胀程度等。2.蝉翼藤各萃取部位的潜在抗风湿活性通过其体内外的抗炎、镇痛及免疫调节活性进行评估。抗炎活性评价采用角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀模型,观察各极性部位对足肿胀度及PGE2水平的影响。镇痛活性采用热板镇痛实验考察。体内外的免疫调节作用通过小鼠体内的碳粒廓清实验和小鼠脾细胞体外的转化增殖实验来评价。3.对遴选出的潜在抗风湿活性部位的体内活性验证采用AA大鼠模型实验完成,具体的治疗效果通过以下指标综合评估：关节炎指数,体重增幅,炎症足足周,解剖变化,免疫器官肿胀度,血清和(或)肝脏中SOD、GSH、OH·、NO、MDA、NAG、SA、ALP、 AST、ALT水平,血清中白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化因子-1 (MCP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)水平和血细胞计数结果等。4.有效部位中单体的分离依靠多种色谱方法联用完成,采用的主要色谱方法有中压硅胶柱色谱和LH-20凝胶柱色谱法。化合物的结构鉴定依赖多种波谱方法的综合应用。蝉翼藤的脂肪油和挥发性成分的构成分析采用GC-MS法,具体的化合物鉴定采取与内建谱库及与标准烷烃保留值对照的方法。5.蝉翼藤中的代表性山酮对AA小鼠的治疗作用采取与上述类似的佐剂诱导关节炎模型实验,主要评价内容包括临床观察指标和血清中的标志性酶、氧化应急水平、组织降解物浓度、促炎细胞因子水平等。6.蝉翼藤中山酮抗风湿机制研究主要通过观察1,7-二羟基-3,4-二甲氧基山酮(X-3)对MH7A细胞的增殖和促炎细胞因子分泌的抑制作用来分析,并结合W-B法和流式细胞术分析其对可能的效应信号通路的调节与生物效应之间的关联性。结果：1.蝉翼藤的水提物和醇提物均能有效地治疗AA,表现为各临床观察指标的改善和免疫器官肿胀的逆转；醇提物的疗效相对于水提物更优。2.蝉翼藤的二氯甲烷萃取部位(SID)具有显著的抗炎、镇痛和免疫抑制活性,是主要的抗风湿活性部位。该极性部位对角叉菜胶导致的小鼠急性足肿胀表现出强烈的抑制作用,同时能显著降低炎症足中PGE2的浓度水平；延长小鼠对由热所致疼痛的反应时间；印度墨水实验中,观察到对小鼠碳粒廓清率的下调作用；并对由LPS和ConA诱发小鼠脾细胞体外的转化和增殖具有抑制作用。3.SID能对AA大鼠的炎症症状产生确切的治疗作用,体重增幅减小、足肿胀、免疫器官肿大和滑膜组织增生等症状均得到有效控制。同时它对异常变化的血液生化指标和细胞因子水平(NO, MDA, OH·, SOD, GSH, AST, ALT, ALP, NAG, SA, IL-1, TNF-α, MCP-1和VEGF)等均产生了恢复性调节作用。4.从蝉翼藤的主要活性部位中分离并鉴定了25个化合物,其中包含12个已知山酮类化合物及1个新的山酮,另有6个化合物为首次从该植物中分离获取。脂肪油的GC-MS谱图中,55个信号中的34个被成功鉴定,已鉴定峰面积占总面积97.18%,主要化合物为十六烷酸(36.89%)和十八碳烯酸(31.12%)。从挥发性成分的48个信号中鉴定出29个化合物,所占总信号面积达83.71%,其中主要化合物类型为单萜(23.12%)和脂肪酸(21.70%)。5.所有代表性山酮对AA小鼠均具有明显的治疗作用,它们可显著降低血清中促炎因子IL-1、TNF-α、MCP-1和VEGF的水平,并逆转血清和肝脏中MDA、GSH、NAG和SA水平的异常变化。6.X-3通过上调p38通路对MH7A细胞产生周期阻滞作用,进而抑制了细胞的异常增殖；通过下调JNK通路抑制了细胞促炎因子IL-1p和IL-6的分泌；通过上调NF-κB通路产生促凋亡作用,对细胞的增殖也起到负性调节作用。结论：蝉翼藤具有确切的体内抗风湿作用,其二氯甲烷部位具有良好的抗炎、镇痛和免疫抑制活性,且对AA大鼠具有显著的治疗效果,是潜在的抗风湿有效部位。对该部位的分离主要获得若干山酮类成分,鉴于其已有活性报道和其对AA小鼠产生的直接治疗作用,该类成分被认为是蝉翼藤中发挥抗风湿作用的重要活性物质,其对类风湿关节炎的治疗作用部分地来自于对滑膜成纤维细胞的增殖和促炎因子分泌的抑制作用。在上述过程中,山酮对MAPKs通路的选择性调节和对NF-κB通路的上调具有至关重要的作用。
【关键词】：蝉翼藤 山酮 类风湿性关节炎 物质基础 作用机制
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 主要缩略语表11-12
• 摘要12-15
• Abstract15-18
• 前言18-21
• 参考文献19-21
• 第一部分 研究背景及本论文研究思路21-38
• 1. 蝉翼藤的研究进展21-25
• 1.1 化学成分研究现状21-22
• 1.2 药理活性22-24
• 1.3 临床应用24-25
• 1.4 质量控制及其他25
• 2. 类风湿性关节炎的现代认识及滑膜成纤维细胞突变的病理意义25-29
• 2.1 FLS的生理特征及功能25-26
• 2.2 RA-FLS的病理变化26-27
• 2.3 与RA-FLS异常突变相关的主要信号转导通路27-28
• 2.4 小分子抑制剂对NF-κB和MAPKs通路的干预与RA治疗28-29
• 3. 本论文研究的思路和方案29-31
• 3.1 研究意义29
• 3.2 研究方案和技术路线29-31
• 参考文献31-38
• 第二部分 蝉翼藤抗风湿活性的体内评价38-45
• 1. 实验材料38-39
• 1.1 药材采集及提取物制备38-39
• 1.2 试剂39
• 1.3 实验设备及仪器39
• 1.4 实验动物39
• 2. 实验方法39-41
• 2.1 急性毒性评价39
• 2.2 完全弗氏佐剂诱导关节炎(AA)小鼠模型39-40
• 2.3 给药方式40
• 2.4 小鼠足肿胀度评价40
• 2.5 小鼠胸腺及脾指数测定40
• 2.6 关节破坏程度病理学评价40
• 2.7 数据统计40-41
• 3. 实验结果41-44
• 3.1 SIW急性毒性测试结果41
• 3.2 SIW和SIAQ对AA小鼠临床指标的影响41-42
• 3.3 小鼠关节病理切片分析42-44
• 4. 讨论和小结44
• 参考文献44-45
• 第三部分 蝉翼藤抗风湿活性有效部位筛选45-56
• 1. 实验材料45-46
• 1.1 蝉翼藤醇提物制备及部位分离45
• 1.2 试剂及药物45-46
• 1.3 实验设备及仪器46
• 1.4 实验动物46
• 2. 实验方法46-48
• 2.1 急性毒性评价46-47
• 2.2 角叉菜胶致小鼠急性足肿胀实验47
• 2.3 炎症组织中PGE_2的含量测定47
• 2.4 热板实验47
• 2.5 炭粒廓清实验47-48
• 2.6 脾细胞转化增殖实验48
• 3. 实验结果48-53
• 3.1 急性毒性评价48-49
• 3.2 角叉菜胶致小鼠足肿胀实验49-50
• 3.3 炎症组织中PGE_2含量50-51
• 3.4 热板镇痛实验51
• 3.5 炭粒廓清实验51-52
• 3.6 脾细胞体外转化增殖实验52-53
• 4. 讨论和小结53-54
• 参考文献54-56
• 第四部分 蝉翼藤二氯甲烷部位体内抗风湿活性研究56-69
• 1. 实验材料56-57
• 1.1 试剂及药物56
• 1.2 药材采集及有效部位制备56
• 1.3 实验设备及仪器56
• 1.4 实验动物56-57
• 2. 实验方法57-59
• 2.1 完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠模型57
• 2.2 给药方案57
• 2.3 大鼠足肿胀及体重测量57
• 2.4 AA大鼠关节炎严重程度的临床评价57-58
• 2.5 大鼠胸腺及脾指数的测定58
• 2.6 关节破坏程度病理学评价58
• 2.7 血样及肝脏样本采集58
• 2.8 血清中生化指标分析及血浆中细胞因子测定58
• 2.9 大鼠肝脏中生化指标测定58
• 2.10 数据统计58-59
• 3. 结果59-65
• 3.1 大鼠基本体征指数变化59-60
• 3.2 SID对AA大鼠免疫器官重量及血液细胞计数的影响60-62
• 3.3 SID对AA大鼠关节病理改变的作用62-63
• 3.4 SID对AA大鼠血清及肝脏中主要生化指标的影响63-65
• 3.5 SID对血浆中细胞因子水平影响65
• 4. 讨论和小结65-67
• 参考文献67-69
• 第五部分 蝉翼藤二氯甲烷部位的化学成分研究69-92
• 1. 实验部分69-72
• 1.1 仪器与试剂69-70
• 1.2 药材标本采集70
• 1.3 提取与分离流程70-72
• 1.4 挥发性组分及脂肪油构成分析72
• 2. 化学成分分离结果及化合物鉴定72-87
• 2.1 化合物1的结构鉴定72-74
• 2.2 化合物2的结构鉴定74-75
• 2.3 化合物3的结构鉴定75
• 2.4 化合物4的结构鉴定75-76
• 2.5 化合物5的结构鉴定76
• 2.6 化合物6的结构鉴定76-77
• 2.7 化合物7的结构鉴定77-78
• 2.8 化合物8的结构鉴定78-79
• 2.9 化合物9的结构鉴定79
• 2.10 化合物10的结构鉴定79-80
• 2.11 化合物11的结构鉴定80-81
• 2.12 化合物21的结构鉴定81
• 2.13 化合物22的结构鉴定81-83
• 2.14 化合物12的结构鉴定83-84
• 2.15 化合物13的结构鉴定84
• 2.16 化合物16的结构鉴定84-85
• 2.17 其他化合物的结构鉴定85-87
• 3. 蝉翼藤挥发性成分及脂肪油构成分析87-90
• 3.1 蝉翼藤挥发性成分的化学构成87-88
• 3.2 蝉翼藤脂肪油的化学构成88-90
• 4. 讨论和小结90
• 参考文献90-92
• 第六部分 蝉翼藤中代表性山酮的体内抗风湿活性研究92-103
• 1. 实验材料92
• 1.1 试剂92
• 1.2 实验设备及仪器92
• 1.3 实验动物92
• 2. 实验方法92-94
• 2.1 急性毒性评价92-93
• 2.2 完全弗氏佐剂诱导关节炎(AA)小鼠模型93
• 2.3 给药方式93
• 2.4 小鼠足肿胀及体重测量93
• 2.5 AA小鼠关节炎严重程度的临床评价93
• 2.6 小鼠胸腺及脾指数的测定93
• 2.7 关节破坏程度病理学评价93
• 2.8 血样及肝脏样本采集93
• 2.9 血清中细胞因子的测定93-94
• 2.10 肝脏中生化指标测定94
• 2.11 数据统计94
• 3. 结果94-100
• 3.1 急性毒性评价94
• 3.2 小鼠基本体征指数变化94-96
• 3.3 山酮对AA小鼠内脏重量的影响96-97
• 3.4 山酮对AA小鼠关节病理改变的作用97-98
• 3.5 山酮对AA小鼠肝脏中主要生化指标的影响98-99
• 3.6 山酮对血清中细胞因子水平影响99-100
• 4. 讨论和小结100-101
• 参考文献101-103
• 第七部分 1,7-二羟基-3,4-二甲氧基山酮抗风湿机制研究103-119
• 1. 实验材料104
• 1.1 试剂及细胞104
• 1.2 实验设备及仪器104
• 2. 实验方法104-106
• 2.1 细胞培养及传代104-105
• 2.2 MTT实验105
• 2.3 细胞周期分布及凋亡率分析105
• 2.4 细胞培养液中细胞因子水平测定105-106
• 2.5 Western blot实验106
• 2.6 数据统计和分析106
• 3. 结果106-115
• 3.1 X-3具有显著的体外抗MH7A细胞增殖作用106-107
• 3.2 X-3对MH7A细胞的作用可能通过调节MAPKs和NF-κB通路实现107-108
• 3.3 X-3对MH7A细胞的抑制主要通过细胞周期阻滞而非促凋亡的方式实现108-110
• 3.4 X-3通过上调p38通路所诱发的G_1/S期阻滞是其抗增殖的主要机制110-111
• 3.5 X-3对MAPKs通路及其下游通路具有选择性调节作用111-113
• 3.6 X-3通过对NF-κB通路上调实现了对MH7A细胞的促凋亡作用113
• 3.7 X-3通过下调JNK通路抑制了MH7A细胞的促炎因子分泌113-115
• 4. 讨论和小结115-116
• 参考文献116-119
• 总结与展望119-121
• 附录一 大鼠体内的2-羟基-1,7-二甲氧基山酮的定量测定及药代动力学研究121-132
• 1. 实验材料121-122
• 1.1 化合物及试剂121-122
• 1.2 实验设备及仪器122
• 1.3 实验动物122
• 2. 实验方法122-125
• 2.1 LC-MS分析条件122-123
• 2.2 标准溶液的制备123
• 2.3 标准曲线及质控样品的制备123-124
• 2.4 样品制备124
• 2.5 方法学考察124-125
• 2.6 药代动力学研究125
• 3. 结果和讨论125-130
• 3.1 LC-MS分析方法的建立125-126
• 3.2 样品制备方法优化126
• 3.3 检测方法的选择性和线性126-127
• 3.4 检测方法的准确度及精密度127
• 3.5 检测方法的基质效应及回收率127-128
• 3.6 检测方法的稳定性128
• 3.7 给药方式的选择128-129
• 3.8 大鼠体内X-2药代动力学研究结果129-130
• 4. 小结130
• 参考文献130-132
• 附录二 2-羟基-1,7-二甲氧基山酮纳米微囊的制备及其132-142
• 1. 实验材料132-133
• 1.1化合物及试剂132-133
• 1.2 实验设备及仪器133
• 1.3 实验动物133
• 2. 实验方法133-135
• 2.1 HPLC分析条件133
• 2.2 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)中X-2溶解度测定133-134
• 2.3 空白及载药纳米微囊的制备134
• 2.4 P-X-2-NIOs分散系及X-2悬浊液的光镜显微观察134
• 2.5 纳米微囊的扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察134
• 2.6 纳米微囊的透射电镜(transmission electron microscopy,TEM))观察134
• 2.7 纳米微囊的粒径分布及zeta电压分析134
• 2.8 包封率实验134-135
• 2.9 P-X-2-NIOs的体外释放135
• 2.10 药代动力学研究135
• 3. 结果和讨论135-140
• 3.1 X-2在PBS中的溶解性极差135-136
• 3.2 P-X-2-NIOs的特征研究136-137
• 3.3 P-X-2-NIOs包封率实验结果137-138
• 3.4 P-X-2-NIOs制备处方优化138
• 3.5 体外释放实验结果138-139
• 3.6 P-X-2-NIOs改善了X-2的体内药代动力学表现139-140
• 4. 小结140
• 参考文献140-142
• 附录三 蝉翼藤中山酮类化合物的抗肿瘤活性研究142-149
• 1. 实验材料142-143
• 1.1 试剂及细胞142-143
• 1.2 实验设备及仪器143
• 1.3 实验动物143
• 2. 实验方法143-144
• 2.1 细胞培养及传代143
• 2.2 MTT实验143-144
• 2.3 含肝癌细胞腹水获取及实体瘤接种144
• 2.4 给药方案及指标测定144
• 3. 结果144-147
• 3.1 山酮对A549细胞的体外增殖抑制作用144-145
• 3.2 山酮抗肿瘤的构效关系分析145-147
• 3.3 山酮能有效地抑制实体瘤的生长147
• 4. 讨论和小结147-148
• 参考文献148-149
• 附录四 主要化合物波谱图149-165
• 攻读博±学位期间取得的研究成果165-166
• 致谢166-167
• 作者简介167

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 李勇文;李丽;;蝉翼藤对大鼠免疫功能的调节作用(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年53期

2 张丽杰,张琳,徐丽珍,杨学东,邹忠梅,杨世林;蝉翼藤根中的一个新二苯酮[J];药学学报;2005年06期

3 杨学东,徐丽珍,杨世林;蝉翼藤茎化学成分研究(Ⅱ)[J];中草药;2002年10期

4 ;Therapeutic effects of glucosides of Cheanomeles speciosa on collagen-induced arthritis in mice[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年11期

5 乔智胜,陈瑞华;河南蜂胶抗菌活性成分的研究[J];中国中药杂志;1991年08期

6 石磊;康文艺;;蝉翼藤根茎化学成分研究[J];中国中药杂志;2008年07期

7 尹彤东;五味藤的生药鉴定[J];中药材;1988年06期

8 李丽;李勇文;唐爱存;李梅;钟全强;;蝉翼藤氯仿提取物的抗炎和免疫增强作用[J];中药药理与临床;2011年04期

9 容明智;李丽;李勇文;唐春燕;庞文肖;程钰;;甲基阿魏酸对PDGF—BB刺激的肝星状细胞增殖的影响[J];右江民族医学院学报;2012年06期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 秦文杰;短柱肖菝葜化学成分及质量控制研究[D];北京中医药大学;2007年

，

本文编号：539890