选择性脾酪氨酸激酶抑制剂P505-15与类风湿性关节炎的相关性研究

发布时间：2017-07-15 10:02

  本文关键词：选择性脾酪氨酸激酶抑制剂P505-15与类风湿性关节炎的相关性研究

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【摘要】：背景类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性、多关节炎为主要临床表现的慢性、进行性、系统性、自身免疫性疾病,全身多发关节受累。RA是一种复杂的退行性疾病,其发病过程中涉及到大量炎性和非炎性细胞。RA可反复迁延多年,关节内滑膜组织过度增殖,形成血管翳,对关节软骨、骨以及韧带的造成渐进性侵袭性破坏,最终将导致关节强直、畸形及关节功能丧失,致重度残疾,对人类健康的危害极大。基于对RA的发病机制以及相关的细胞和分子的病理生理研究发现,脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase, Sy k)在RA的发病机制中起着关键性的作用。Syk是一个下游信号传导因子级联反应激活的主要调节酶,在自身抗体的产生过程中,以及在多种内在免疫效应因子的作用中,具有无可替代的中心作用。免疫细胞在RA的发病过程中,也发挥至关重要的作用,而Syk也是这些免疫细胞活化的中心环节,在这些细胞的信号转导过程中发挥重要作用。Syk在RA发病及病情进展中发挥着诸多重要作用,这使得Syk抑制剂成为RA治疗的非常有前景的候选药物。众多制药和生物技术公司对抑制剂表现出了浓厚的兴趣。目前针对RA治疗和其他一些适应症的许多Syk小分子抑制剂正处在不同研发阶段。p505-15是一种新型的、高度选择性Syk抑制剂,相对于其它一些小分子Syk抑制剂,p505-15还没有被系统的深入研究过。目的通过分子生物学、细胞学及动物实验、体内/体外实验等多个方面,系统的探讨p505-15对Syk抑制作用的高效性、高特异性,对CIA发病及病情发展的有效抑制。方法通过SUDHL4细胞株,利用蛋白印迹分析法检测BCR介导的BLNK的磷酸化,测定Syk的活性；检测BCR介导的Syk的磷酸化,测定Lyn的活性；验证p505-15抑制Syk的特异性。人的全血在抗-BCR或PMA刺激后诱导SYK依赖的或非依赖的信号系统和B细胞的功能性活化,使用流式细胞仪检测细胞活化程度验证p505-15特异性抑制Syk依赖的白细胞信号系统的转导和B细胞的激活。将口服p505-15给药后的小鼠血液通过磷酸化流式细胞仪测量Syk活性验证p505-15在体内抑制Syk的高效性及可逆性。建立小鼠CIA模型,通过CIA小鼠关节炎指数评分、后踝关节肿胀程度以及CIA小鼠关节组织HE染色切片观察关节形态学变化、番红O关节软骨染色、关节滑膜组织巨噬细胞浸润,并使用免疫组化方法测定血清抗-CⅡ IgG1和IgG2a及血清TNF-α、IL-6和IL-17水平等方法验证p505-15抑制CIA小鼠关节炎的发病、发展及相关炎性因子的产生。通过获取分离培养的原代人RA滑膜细胞,检测其分泌TNF-α, IL-6和IL-17的水平,验证p505-15可抑制人RA促炎性反应从而削弱自身免疫性关节炎的发病。结果1、在S UDHL4细胞株,各不同浓度的p505-15均抑制了BLNK Tyr84的磷酸化,提示Syk活性得到抑制,并显示了明显的浓度依赖性；而Lyn活性在试验中的各种p505-15浓度下均没有观察到相应的抑制。Syk半数最大抑制所需要的p505-15浓度在0.16-0.4uM之间。2、在人的全血中,p505-15抑制了Syk信号系统介导的ERK Tyr204的磷酸化(pERK Tyr204;均值IC50±EM,0.27um±0.02)和白细胞的激活(CD69；均值IC50±SEM,0.28um±0.03),但没有抑制Lyn依赖的信号系统介导的Syk Y352的磷酸化(pSyk Y352).3、小鼠予以p505-15 15mg/kg bid的口服剂量后,给药2小时至6小时期间观察到Syk的活性被抑制超过50%,其中在服药后3小时Syk的活性抑制最大,为80%左右；6小时以后Syk活性逐渐恢复,至24小时Syk活性恢复至80%以上。在整个实验过程中没有观察到Lyn活性抑制。4、成功获取小鼠CIA模型,小鼠关节炎指数评分在第28-30天时急剧升高,之后趋于平缓,于实验的第36天基本达到顶峰,AI最高计分为9.2±0.7。CIA小鼠后踝关节最肿胀处厚度均随时间延长而增加,至第32天时趋于平缓,于初次免疫后第36天达到顶峰,最高值为42±2%。口服p505-15的小鼠较口服赋形剂的空白对照组小鼠的足爪红肿程度明显减轻,关节炎指数明显降低。足爪肿胀最大减轻20%,AI值最大降低3.4,统计学显示P0.01。5、HE染色显示口服赋形剂的空白对照组CIA小鼠的关节有明显的慢性滑膜炎,关节及滑膜层增生,滑膜翳形成,关节内中性粒细胞浸润和纤维蛋白形成,周围基质中的原始中性粒细胞浸润；在口服p505-15的治疗组CIA小鼠的关节结构基本完好,炎性细胞浸润和骨侵蚀明显被抑制。HE染色骨侵蚀组织学评分显示口服赋形剂的空白对照组CIA小鼠评分为2.9±0.4,口服p505-15的治疗组CIA小鼠评分为1±0.1,统计学显示P0.01,表明具有显著性差异。6、番红O染色显示口服赋形剂的空白对照CIA小鼠的关节表现出明显的软骨破坏,关节内的透明软骨表面不规则,提示软骨缺失,软骨潮线的缺失和软骨细胞固缩；而在口服p505-15治疗组的CIA小鼠这一现象明显减轻,相当于正常透明软骨的各级透明软骨显示清晰。关节软骨侵蚀组织学评分显示,口服赋形剂的空白对照CIA小鼠评分为2.7±0.2,口服p505-15治疗组的CIA小鼠评分为1.3±0.1,P0.01表明具有显著性差异。7、免疫组化分析滑膜组织切片中CD68的表达检测滑液的巨噬细胞浸润显示在口服p505-15的治疗组CIA小鼠的切片CD68表达较赋形剂的空白对照组CIA小鼠明显降低。CD68评分分别为0.8±0.1和3.1±0.3,P0.01,表明具有显著性差异。8、免疫组化方法测定血清抗-CⅡ IgG1和IgG2a,结果显示与口服赋形剂的空白对照组CIA小鼠相比较,口服p505-15的治疗组CIA小鼠所有的抗-CII抗体皆有显著的降低,统计学显示p0.01,表明具有显著性差异。9、使用免疫组化方法予以测定血清TNF-α、IL-6和IL-17水平显示口服p505-15小鼠的三种炎性因子水平有显著下降,统计学显示p0.01,表明具有显著性差异。10、获取分离培养的原代人RA滑膜细胞,使用2Ong/ml IL-1β处理后取上清液行示p505-15处理显著的降低了TNF-a,TNF-α, IL-6IL-6和IL-17水平IL-17测定。数据显,提示p505-15抑制促炎性反应。结论Syk是许多免疫系统的疾病的重要的治疗靶点。p505-15是高度特异性的和有效的小分子抑制剂,细胞实验和体内实验均显示Syk具有强效的免疫调节活性。在控制炎症性疾病的免疫功能,使用p505-15对Syk的特异性抑制是一个有效的且安全可靠的可选方案。
【关键词】：脾酪氨酸激酶 抑制剂 类风湿性关节炎 胶原诱导性小鼠关节炎
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符号说明14-16
• 第一部分 前言16-20
• 第二部分 材料与方法20-43
• 第三部分 结果43-47
• 第四部分 讨论47-50
• 第五部分 结论50-51
• 附图51-62
• 参考文献62-68
• 致谢68-69
• 攻读学位期间发表论文69-70
• 学位论文评阅及答辩情况70-71
• 英文论文(一)71-116
• 英文论文(二)116-131

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张玲玲;魏伟;汪庆童;陈镜宇;陈尹;吴华勋;;芍药苷对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞G蛋白偶联信号的调节作用[J];中国药理学通报;2008年03期

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本文编号：543349