活性氧簇和内质网应激在艰难梭菌毒素B诱导的肿瘤细胞死亡中的作用

发布时间：2017-07-19 17:01

  本文关键词：活性氧簇和内质网应激在艰难梭菌毒素B诱导的肿瘤细胞死亡中的作用

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【摘要】：艰难梭菌是一种革兰氏阳性的人类肠道正常菌群,在肠道菌群失衡时(尤其在抗生素滥用的背景下),是住院性腹泻和伪膜性肠炎的主要致病菌。在过去十几年中,由于超毒力菌株的出现,艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的发病率和死亡率显著增加。毒素A(Tcd A)和毒素B(Tcd B)是艰难梭菌的两个主要毒力因子,具有相似的作用机制,二者的致炎和致凋亡作用已经被广泛报道。本实验室前期研究发现,重组的Tcd B(r Tcd B)可以在结肠癌细胞系CT26中诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)。ICD是一种近年来提出的新的死亡模式,主要特征是濒临死亡的肿瘤细胞会释放或表面表达一些可以激活机体免疫系统的死亡相关损伤因子(deth association molecular patterns,DAMPs),从而诱导抗肿瘤抗原的免疫效应。目前只有少数几种临床上成功应用的抗肿瘤药物具有刺激ICD的作用,而且研究发现活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)在调控濒死癌细胞的免疫原性和几种关键DAMPs释放的通路中发挥重要作用。虽然对Tcd A和Tcd B的毒性机制的研究已经有了很大进展,但关于其诱导细胞死亡的机制却存在很多争议,是否ROS和ER stress参与其中也无系统报道。本文主要检测了ROS和ER stress在r Tcd B中毒细胞中的发生情况,并研究了它们在r Tcd B诱导的细胞死亡中的作用。研究结果表明,在CT26细胞中r Tcd B诱导的ROS增加不依赖于毒素浓度,胞内的ROS在毒素(100 ng/m L)处理后的24小时内处于动态变化中。三种ROS的药理学抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,使用浓度5 m M)、二甲基碘苯翁(DPI,使用浓度5μM)和抗霉素A(Antimycin A,使用浓度5μM)不仅可以显著抑制r Tcd B诱导的PS膜外表达和sub-G1期细胞含量,也显著抑制了因r Tcd B处理引起的Bcl-2蛋白表达的减少和磷酸化STAT3蛋白表达的增加,说明ROS通过调控Bcl-2和磷酸化STAT3蛋白表达参与r Tcd B诱导的细胞死亡。此外,r Tcd B也可以在人类结肠癌细胞系HCT-8中诱导ROS产生。NAC通过抑制胞内ROS产生、抵抗线粒体膜电位改变、抑制Bcl-2蛋白表达下调和抑制自噬蛋白LC3B(Light Chain 3 B isoforms)的转归保护r Tcd B中毒的细胞。ER stress的两条关键的未折叠蛋白反应支路—PERK和IRE1α支路在r Tcd B中毒的CT26细胞中被活化。然而,葡萄糖基转移酶双位点突变的Tcd B也可以在CT26细胞中诱导这两条支路的活化,说明rTcd B对ER stress的诱导不依赖于毒素的葡萄糖基转移酶活性的。此外,r Tcd B并不影响内质网凋亡途径关键蛋白CHOP(C/EBP-homologous protein)的表达,相反,突变毒素B可以诱导它上调,说明CHOP蛋白的表达受到葡萄糖基转移酶或其下游的Rho蛋白活性的调控。Salubrinal是一种特异性的e IF2α(α-subunit of eukaryotic translational initiation factor 2)蛋白脱磷酸化抑制剂,研究发现它通过抑制caspase 9活化和自噬、影响Rac1蛋白的葡萄糖基化来保护r Tcd B中毒的细胞。综上,由rTcd B在CT26细胞中诱导的ER stress并不参与最终的细胞死亡,它更可能是对抗r Tcd B中毒的一种保护机制。动物实验结果表明,经活细胞challenge后,用r Tcd B(500 ng/m L)处理6小时的细胞免疫的小鼠没有肿瘤生长。用ER stress药理学抑制剂(TUDCA(tauroursodeoxycholic acid)或4-PBA(4-phenylbuturate))与r Tcd B共处理6小时的细胞免疫的小鼠也没有肿瘤生长,说明ER stress不参与r Tcd B诱导的ICD。用DPI或Anti.A与r Tcd B共处理的CT26细胞免疫的小鼠在challenge后部分长出了肿瘤,但用NAC与r Tcd B共处理细胞接种的小鼠并无肿瘤生长,这可能与NAC是在ROS产生后才发挥清除作用,而DPI和Anit.A则直接从源头上抑制ROS产生有关。对HSP90、HSP70和HMGB1蛋白胞外表达、钙网织蛋白(CRT)质膜表达、自噬蛋白LC3B表达以及胞内外ATP含量的检测结果表明,DPI和Anti.A显著抑制了r Tcd B诱导的三种蛋白的胞外分泌和CRT质膜表达,但NAC对它们的影响有限。三种抑制剂均显著抑制了自噬蛋白LC3B的转归,但并不影响ATP的胞外分泌。由以上数据可知,ROS可以通过抑制关键DAMPs的分泌或位移(HSP90、HSP70、HMGB1和钙网织蛋白)以及影响自噬来影响ICD。综上所述,本研究证明rTcd B处理导致了胞内ROS的增加和ER stress的发生,ROS参与rTcd B诱导的细胞凋亡和ICD,但ER stress并不参与这两种细胞死亡形式。
【关键词】：艰难梭菌毒素B 活性氧簇 内质网应激 细胞死亡 免疫原性细胞死亡
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 中英文对照和缩略词表14-16
• 第一章 绪论16-28
• 1.1 艰难梭菌及其致病机制16-19
• 1.1.1 艰难梭菌简介及其感染现状16-17
• 1.1.2 艰难梭菌的致病因子17-18
• 1.1.3 毒素A和毒素B的作用机制18-19
• 1.2 细胞死亡及其研究进展19-24
• 1.2.1 细胞凋亡20-21
• 1.2.2 自噬21-22
• 1.2.3 免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death，ICD）22-23
• 1.2.4 坏死23-24
• 1.3 艰难梭菌毒素诱导的细胞死亡24-25
• 1.4 本课题的研究目的、意义与主要内容25-28
• 1.4.1 研究目的25
• 1.4.2 研究意义25-26
• 1.4.3 主要研究内容26-28
• 第二章 活性氧簇在TcdB诱导的细胞凋亡中的作用28-56
• 2.1 引言28-29
• 2.2 实验材料29-34
• 2.2.1 细胞和毒素29
• 2.2.2 主要设备与耗材29-30
• 2.2.3 主要药品与试剂30-31
• 2.2.4 主要实验用溶液配制31-34
• 2.3 实验方法34-43
• 2.3.1 细胞培养34
• 2.3.2 细胞复苏34-35
• 2.3.3 细胞传代35
• 2.3.4 细胞冻存35
• 2.3.5 重组艰难梭菌毒素B的表达纯化35-36
• 2.3.6 亲和层析纯化蛋白36-37
• 2.3.7 细胞病变效应及细胞毒性检测37
• 2.3.8 细胞内活性氧的检测37
• 2.3.9 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡37-38
• 2.3.10 Sub-G1 法检测细胞凋亡38-39
• 2.3.11 DNA ladder39-40
• 2.3.12 Western blot40-42
• 2.3.13 罗丹明检测胞内线粒体膜电位的改变42-43
• 2.4 结果与讨论43-55
• 2.4.1 重组艰难梭菌毒素B(rTcdB)的表达纯化及其性质鉴定43-46
• 2.4.2 rTcdB处理诱导细胞内ROS的水平升高46-47
• 2.4.3 ROS参与r TcdB引起的细胞凋亡47-50
• 2.4.4 NAC保护艰难梭菌毒素B引起的细胞死亡效应的机制50-55
• 2.5 小结55-56
• 第三章 内质网应激在TcdB诱导的细胞凋亡中的作用56-80
• 3.1 引言56-57
• 3.2 实验材料57-59
• 3.2.1 细胞和毒素57
• 3.2.2 主要设备及耗材57
• 3.2.3 主要试剂57-58
• 3.2.4 主要溶液配制58
• 3.2.5 引物58-59
• 3.3 实验方法59-64
• 3.3.1 细胞培养、传代、复苏及冻存方法59
• 3.3.2 重组突变毒素B（mrTcdB）的表达纯化59
• 3.3.3 实时定量PCR （Real-time PCR）59-61
• 3.3.4 逆转录PCR61-62
• 3.3.5 Western Blot检测蛋白表达62
• 3.3.6 细胞凋亡检测62
• 3.3.7 细胞病变和细胞毒性效应62-63
• 3.3.8 乳酸脱氢酶（LDH）测试63-64
• 3.4 结果与讨论64-78
• 3.4.1 重组突变毒素B（mrTcdB）的表达、纯化与细胞毒性和病变效应测定64-65
• 3.4.2 rTcd B 诱导 ER stress65-68
• 3.4.3 艰难梭菌毒素B对凋亡性ER stress分子标记物的影响68-71
• 3.4.4 rTcdB引起的ER stress是葡萄糖基转移酶非依赖的71-72
• 3.4.5 Salubrinal对rTcdB中毒细胞的保护效应及其机制研究72-78
• 3.5 小结78-80
• 第四章 ROS和ER stress在TcdB诱导的免疫原性细胞死亡中的作用80-96
• 4.1 引言80-84
• 4.1.1 ICD相关DAMPs简介80-83
• 4.1.2 ICD诱导剂83-84
• 4.2 实验材料84-85
• 4.2.1 细胞和毒素84
• 4.2.2 主要试剂84-85
• 4.2.3 主要实验用试剂配制85
• 4.2.4 主要仪器85
• 4.3 主要实验方法85-89
• 4.3.1 Western blot检测上清和全细胞蛋白85-86
• 4.3.2 细胞凋亡状态分析86-87
• 4.3.3 CRT膜转位分析87-88
• 4.3.4 小鼠免疫模型的建立88-89
• 4.4 结果和讨论89-95
• 4.4.1 ROS和ER stress对r TcdB中毒的CT26 细胞凋亡的影响89-90
• 4.4.2 ROS和ER stress在r TcdB中毒的CT26 细胞肿瘤免疫模型中的作用90-93
• 4.4.3 ROS影响r TcdB在肿瘤细胞中诱导的ICD的相关机制93-95
• 4.5 小结95-96
• 结论与展望96-98
• 结论96
• 论文创新点96
• 展望96-98
• 参考文献98-113
• 攻读博士学位期间取得的研究成果113-114
• 致谢114-115
• 附件115

【参考文献】

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1 ;Clostridium difficile infections in China[J];Journal of Biomedical Research;2010年06期

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本文编号：563876