SOCE对动脉粥样硬化小鼠内皮祖细胞功能影响的研究

发布时间：2017-07-26 03:13

  本文关键词：SOCE对动脉粥样硬化小鼠内皮祖细胞功能影响的研究

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【摘要】：研究背景及目的目前认为,血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生的初始环节。多种AS危险因素如高脂血症、吸烟、糖尿病、高血压等均可以导致血管内皮细胞损伤而促进AS的发生发展。因此,促进血管内皮细胞损伤的修复是预防AS发生的关键。内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cell,EPC)具有成血管能力和向内皮细胞分化能力,一度被认为是血管内皮损伤修复的种子细胞。但是既往研究发现,AS发展过程中常伴随EPC功能异常,导致EPC对血管内皮损伤进行修复的能力降低,从而导致AS的发生、发展。因此,如何减缓或逆转EPC功能异常很可能是预防AS进展的关键,但由于目前仍未阐明AS发展过程中EPC功能异常的相关机制,极大地妨碍了以EPC为靶点治疗AS的进程。钙库操纵性钙内流(Store operated Ca2+entry,SOCE)是哺乳动物非兴奋细胞钙离子内流的普遍机制,主要由钙库操纵性通道(Store operated channels,SOC)复合体介导,并与细胞的众多生理功能密切相关。既往其他学者以及本实验室的研究发现,EPC上表达SOC复合体蛋白分子,沉默此类蛋白表达不仅影响SOCE,还影响EPC的增殖、迁移功能,这些结果提示SOCE是调节EPC功能的重要方式。另外,鉴于SOCE对细胞功能调节的广泛性,SOCE的变化可能会引起EPC诸多生理功能改变,反之,SOCE也可能是多种致病因素作用的共同的靶点。这就提示我们,在AS发展过程中,诸多不利因素均可能作用于SOCE,从而引起EPC功能异常。但是在AS的进程中,是否会通过影响SOCE从而引起EPC功能异常至今仍不清楚。基于以上原因,本研究利用AS小鼠模型以及体外应用AS危险因素-氧化型低密度脂蛋白(oxide low density lipoprotein,ox-LDL),以SOCE为切入点研究AS进程中EPC功能异常的作用机制。方法1.AS小鼠EPC增殖、迁移功能及SOCE的改变1.1 AS小鼠模型建立以及EPC的培养、鉴定Apo E-/-小鼠分别给予普通饮食及高脂饮食喂养,高脂饮食以普通颗粒饲料添加0.15%胆固醇和20%脂肪。高脂饮食组小鼠分别于喂养后12周和16周处死,取主动脉行油红O染色以评价AS进展。取小鼠骨髓,经密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,接种于包被了人纤连蛋白的培养板或培养瓶中,以内皮细胞条件培养基培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态及细胞特征。除了以Di I-Ac-LDL和FITC-UEA-I荧光双染法鉴定EPC外,通过免疫荧光检测EPC表面分子标记物CD34、CD133和VEGFR2的表达。1.2 AS小鼠EPC增殖和迁移功能的改变各组小鼠EPC培养5天后,以直接镜下计数和CCK-8检测分析EPC增殖功能,以Transwell方法观察EPC迁移功能。1.3 AS小鼠EPC的SOCE的改变1.3.1 AS小鼠EPC的SOCE振幅和波形改变取培养7天的EPC,孵育钙离子探针Fluo-3后,在激光共聚焦显微镜下观察毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)激活的SOCE,统计数据分析SOCE的振幅及波形改变。1.3.2 AS小鼠EPC的钙振荡改变取培养7天的EPC,孵育钙离子探针Fluo-3后,在激光共聚焦显微镜下观察EPC自发钙振荡以及VEGF激发的钙振荡的变化。1.3.3 AS小鼠EPC的SOC分子表达改变提取EPC总RNA,以RT-PCR观察SOC构成分子的基因在EPC的转录,以实时定量PCR分析SOC关键构成分子基因转录水平的差异。提取细胞总蛋白,以Western blot分析SOC关键构成分子蛋白表达水平的差异。1.4 AS小鼠EPC的e NOS的表达和磷酸化改变以Western blot分析各组EPC的e NOS蛋白(Ser1177)磷酸化水平和表达水平的改变。2.ox-LDL对EPC增殖、迁移功能及SOCE的影响2.1 ox-LDL对EPC增殖、迁移功能的影响分离培养小鼠EPC并给予ox-LDL处理。以直接镜下计数和CCK-8检测分析EPC增殖功能,以Transwell方法观察EPC迁移功能。并以基质胶培养法观察EPC体外成管型生长能力。2.2 ox-LDL对EPC的SOCE的影响2.2.1 ox-LDL对EPC的SOCE振幅和波形的影响培养的EPC给予ox-LDL处理,孵育钙离子探针Fluo-3后,在激光共聚焦显微镜下观察ATP激活的SOCE,统计数据分析SOCE的振幅及波形改变。2.2.2 ox-LDL对EPC的SOC分子表达的影响培养细胞给予ox-LDL处理后,提取细胞总蛋白,以Western blot分析SOC关键构成分子蛋白表达水平的差异。2.2.3 ox-LDL对STIM1蛋白磷酸化的影响培养细胞并给予ox-LDL处理,给予ATP刺激,于刺激后不同时相点提取细胞总蛋白,免疫沉淀富集STIM1蛋白后,以Western blot分析STIM1蛋白丝氨酸磷酸化水平。3.SOCE与EPC增殖、迁移功能的关系3.1抑制SOCE对EPC增殖、迁移功能的影响培养的EPC分别给予SOCE抑制剂和干扰STIM1基因转录处理,激光共聚焦显微镜观察上述策略对SOCE的影响,并以直接镜下计数和CCK-8检测分析EPC增殖功能,以Transwell方法观察EPC迁移功能。3.2抑制SOCE对EPC的e NOS的表达和磷酸化影响培养的EPC分别给予SOCE抑制剂干扰STIM1基因转录处理后,以Western blot分析各组EPC的e NOS蛋白(Ser1177)磷酸化水平和表达水平的改变。结果1.1.AS小鼠EPC增殖、迁移功能及SOCE的改变1.1 AS小鼠模型建立以及EPC的培养、鉴定成功建立AS小鼠模型,表现为高脂喂养组小鼠主动脉脂质斑块显著增加。成功培养小鼠骨髓源性EPC。骨髓单个核细胞接种于条件培养基后,部分细胞逐渐贴壁生长并逐渐变为不规则形、梭形、纺锤形等,部分细胞呈现典型的克隆性及线性生长特性。荧光双染显示培养的细胞大部分同时表达内皮细胞特异性标记物(UEA)并具有结合LDL的能力。免疫荧光检测显示大部分细胞为CD34、CD133、VEGFR2阳性细胞。1.2 AS小鼠EPC增殖和迁移功能的改变随AS进展,EPC的数量显著降低,于高脂饮食喂养后12周及16周分别下降21.5%和45%(p0.05),CCK-8检测显示EPC的增殖活性分别降低28.2%和56%(p0.05),Transwell检测显示成功迁移的EPC数量分别降低34.4%和43.8%(p0.05)。1.3 AS小鼠EPC的SOCE的改变1.3.1 AS小鼠EPC的SOCE振幅和波形改变TG成功诱发EPC的SOCE。随AS进展,EPC的SOCE的振幅逐渐降低,高脂喂养后12周及16周分别降低65.2%和67.3%(p0.05)。另外,钙释放的振幅也有所降低。对SOCE的波形分析发现,随AS的进展,EPC的SOCE的升支、降支斜率都显著下降,其中升支斜率于高脂喂养后12周及16周分别降低65.1%和72.1%(p0.05),降支斜率于高脂喂养12周小鼠的EPC降低了70%(p0.05),而在16周小鼠的EPC只降低了32.6%,差异没有统计学意义。1.3.2 AS小鼠EPC的钙振荡改变在观察到AS小鼠EPC的SOCE改变后,考虑到SOCE是细胞钙振荡的关键组分,并且钙振荡参与调节细胞诸多生理功能。我们随后观察了AS对EPC的钙振荡的影响。结果显示随AS的进展,EPC自发的钙振荡以及VEGF诱导的钙振荡的振幅和频率均显著降低(p0.05)。1.3.3 AS小鼠EPC的SOC分子表达改变为了探讨引起SOCE改变的原因,我们观察了介导SOCE的SOC复合体分子的改变。首先以RT-PCR证实EPC上有SOC分子基因的转录,包括STIM1-2,Orai1-3,TRPC1和TRPC6。随后,我们重点观察了介导SOC复合体关键分子STIM1、Orai1和TRPC1在RNA转录水平和蛋白表达水平的变化,结果显示,随AS进展,上述分子的转录和表达均显著下降(p0.05)。1.4 AS小鼠EPC的e NOS的表达和磷酸化改变前述结果证实,随AS进展,EPC增殖和迁移功能均显著受损,鉴于e NOS对调节EPC增殖和迁移功能的关键作用,我们随后又观察了AS进程中e NOS的表达和磷酸化变化。结果显示,VEGF诱导的e NOS(Ser1177)磷酸化水平随AS进展而显著降低(p0.05),此外,e NOS的蛋白表达水平也随AS发展而降低(p0.05)。2.ox-LDL对EPC增殖、迁移功能及SOCE的影响ox-LDL是目前已知的最关键的AS致病因素,因此,我们体外应用ox-LDL,进一步验证AS进展对EPC功能及SOCE的影响。2.1 ox-LDL对EPC增殖、迁移功能的影响体外给予ox-LDL处理72h后,EPC的数量以及增殖活性呈现剂量依赖性降低,其中100μg/ml的ox-LDL对细胞的影响最显著(p0.05)。低剂量的ox-LDL(25μg/ml)即可明显降低EPC的迁移功能(p0.05),并随剂量增加,效应越显著。另外,我们还观察了ox-LDL对EPC体外成管型生长的影响。结果显示,低剂量的ox-LDL对此影响不明显,但较高剂量的ox-LDL对此影响较为明显。2.2 ox-LDL对EPC的SOCE的影响2.2.1 ox-LDL对EPC的SOCE振幅和波形的影响培养的EPC给予ox-LDL处理24h后,SOCE的振幅显示降低趋势,但与对照组差异不明显。而ox-LDL处理72h后,SOCE的振幅显著低于对照组(p0.05)。分析SOCE的波形发现,ox-LDL处理24h后,SOCE的升支、降支斜率即显著下降(p0.05),于处理72h后更加明显。2.2.2 ox-LDL对EPC的SOC分子表达的影响随后我们观察了SOC关键分子蛋白水平表达的变化,结果显示,ox-LDL处理72h后,STIM1、Orai1和TRPC1蛋白表达虽然有降低趋势,但差异不明显。2.2.3 ox-LDL对STIM1蛋白磷酸化的影响鉴于SOC分子蛋白表达变化不足以充分解释SOCE改变的原因,我们又进一步观察了STIM1蛋白磷酸化的变化。结果显示,ox-LDL处理24h后,STIM1的磷酸化水平显著低于对照组(p0.05),此效应于处理72h后更加明显。3.SOCE与EPC增殖、迁移功能的关系3.1抑制SOCE对EPC增殖、迁移功能的影响SOCE抑制剂2-APB和ML-9显著抑制SOCE振幅,分别降低65.1%和34.7%(p0.05)。2-APB处理72h后,EPC的数量、增殖活性及迁移数量较对照组分别降低52.0%、49.7%和54.5%(p0.05),ML-9处理后分别降低48.4%、57.0%和49.7%(p0.05)。此外,干扰STIM1基因转录也显著抑制SOCE振幅,较对照组下降72.1%(p0.05),并且显著影响EPC的功能,对EPC的数量、增殖活性及迁移数量较对照组分别降低59.4%、64.0%和66.4%(p0.05)。3.2抑制SOCE对EPC的e NOS的表达和磷酸化影响2-APB和干扰STIM1基因转录处理使e NOS的表达分别下降41.3%和52.7%(p0.05),此外,干扰STIM1基因转录后,e NOS的磷酸化水平也显著降低(p0.05)。结论1.在AS的发展过程中,EPC的增殖、迁移功能受到抑制2.在AS的发展过程中,EPC的SOCE受到显著抑制3.在AS的发展过程中,EPC的钙振荡和e NOS的表达及磷酸化降低4.体外给予ox-LDL处理也显著抑制EPC增殖、迁移功能以及SOCE5.SOCE与EPC增殖、迁移功能及e NOS的表达和磷酸化相关6.在AS小鼠以及体外给予ox-LDL都证实,在AS的发展过程中,EPC的增殖和迁移功能受到抑制。其作用机制可能是通过改变SOCE,进而影响钙振荡和e NOS的表达和磷酸化而实现。这提示SOCE有望成为治疗EPC功能异常的新靶点。
【关键词】：钙库操纵性钙内流 内皮祖细胞 动脉粥样硬化 钙振荡 内皮型一氧化氮合酶
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-12
• 中文摘要12-18
• 第一章 前言18-21
• 第二章 AS小鼠EPC增殖、迁移功能及SOCE的改变21-55
• 2.1 材料与方法22-37
• 2.2 结果37-51
• 2.3 讨论51-54
• 2.4 小结54-55
• 第三章 ox-LDL对EPC增殖、迁移功能及SOCE的影响55-73
• 3.1 材料与方法55-64
• 3.2 结果64-71
• 3.3 讨论71-72
• 3.4 小结72-73
• 第四章 SOCE与EPC增殖、迁移功能的关系73-92
• 4.1 材料与方法73-84
• 4.2 结果84-89
• 4.3 讨论89-91
• 4.4 小结91-92
• 全文总结92-93
• 参考文献93-102
• 文献综述一 动脉粥样硬化与内皮祖细胞功能异常的关系102-116
• 参考文献108-116
• 文献综述二 钙库操纵性钙内流的研究进展116-132
• 参考文献122-132
• 攻读学位期间的研究成果132-133
• 致谢133

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本文编号：574500