人参皂苷Rgl拮抗致衰剂致骨髓基质细胞衰者作用及机理研究

发布时间：2017-07-30 04:20

  本文关键词：人参皂苷Rgl拮抗致衰剂致骨髓基质细胞衰者作用及机理研究

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【摘要】：背景：衰老生物学与延缓衰老是社会科学和自然科学共同关注的重大研究课题。2014年国家统计局公布数据显示,中国总人口为13.6亿人,其中年龄超过60岁者达2.02亿,占14.9%,到2020年,中国将进入超级老龄化国家。面临世界和我国人口老化进程加快和人们寿命普遍提高的趋势,确保老年人享有健康和高质量生活已成为社会科学和生命科学共同关注重大问题。因此加快推动衰老生物学与延缓衰老的研究有重要科学意义及社会价值。最新研究表明,机体干细胞衰老是生物个体衰老最直接和根本原因。因此,寻找调控与延缓干细胞衰老途径,阐述其现代生物学机理对延缓人体衰老和防治老年性疾病具有重要意义。我们前期工作证明,造血系统功能衰退与造血干细胞(HSCs)衰老密切相关,采用中医学“补气生血”途径可以延缓HSCs衰老。现代血液学理论认为,血细胞发生是指HSCs在造血诱导微环境(HIM)的精密调控下生成与释放血细胞的动态平衡过程。HIM是HSCs赖以生长发育微环境,HIM的核心成分是骨髓基质细胞(BMSCs),它包括巨噬细胞、成纤维细胞、网状细胞、间充质干细胞和血窦内皮细胞等,它们不仅为造血细胞生长发育提供支架,而且能分泌多种造血生长因子调控造血细胞增殖与分化。可见,BMSCs的生物学特点直接反映造血微环境功能状态。HSCs衰老与HIM功能状态密切相关,阐述HSCs衰老机制和寻找延缓HSCs途径必然离不开对BMSCs功能的研究。人参是中医临床“补气”要药,人参皂苷是其主要的药物成分。课题组前期研究表明,人参皂苷Rg1是人参重要的抗衰老成分,它能拮抗致衰剂对HSC的致衰作用,能使细胞体外生存寿命延长,给衰老大鼠注射人参皂苷Rgl可阻止致衰剂对骨髓造血细胞损伤。人参皂苷Rg1能否通过调控骨髓造血微环境中基质细胞的功能,进而延缓HSCs衰老还尚未见相关报道。目的本研究通过建立D-半乳糖致大鼠衰老模型和BMSCs体外衰老模型,探讨人参皂苷Rg1拮抗致衰剂对BMSCs体内外衰老作用及其生物学机理,旨在阐释人参抗衰老成分调控BMSCs功能与延缓造血细胞衰老的机理,为寻找延缓造血微环境衰老新途径提供理论与实验室依据。方法1.全骨髓贴壁培养法分离纯化BMSCs,观察细胞形态,台盼蓝染色检测细胞活性；密度梯度离心法分离骨髓BMNCs,贴壁培养4h后,收集上层悬浮BMNCs。2.通过衰老相关p-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色,CCK8比色法、细胞周期及凋亡率检测、电镜观察亚细胞结构的方法观察D-gal对BMSCs衰老生物学指标的影响,以建立D-gal体外诱导BMSCs衰老模型。3.将悬浮BMNCs与衰老BMSCs共培养,应用SA-β-Gal染色,CCK8比色法、细胞周期及凋亡率检测,CFU-Mix混合集落形成能力检测的方法观察衰老BMSCs对BMNCs衰老生物学指标及造血功能的影响,4.Rg1与D-gal共培养BMSCs,应用SA-β-Gal染色,透射电镜观察亚细胞结构,CCK8比色法、细胞周期及凋亡率检测,酶学免疫法培养上清中IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF、SCF、IL-1β分泌水平,DCFH-DA荧光法检测胞内ROS水平,激光共聚焦观察胞内ROS荧光强度,WST-8法检测胞内SOD活力,TBA法检测胞内MDA含量,Western blot检测P53、P21、P16、CDK、CDK4、cyclinD、cyclinE的方法,从BMSCs衰老生物学特点、氧化与抗氧化指标、细胞因子表达水平、衰老相关蛋白表达的角度观察Rgl拮抗BMSCs衰老机理。5.Rg1与D-gal作用BMSCs后与BMNCs共培养,应用SA-β-Gal染色,CFU-Mix混合集落形成能力,CCK8比色法、细胞周期及凋亡率检测,DCFH-DA荧光法检测胞内ROS水平,激光共聚焦观察胞内ROS荧光强度,WST-8法检测胞内SOD活力,TBA法检测MDA含量,从BMNCs衰老生物学特点、氧化与抗氧化指标、细胞因子分泌水平的改变三方面观察Rgl拮抗BMSCs后对BMNCs衰老抑制作用及其促进BMNCs增殖分化及造血功能恢复的机理。6.大鼠皮下注射D-gal建立衰老大鼠衰老体内模型,分离纯化BMSCs及BMNCs后,应用SA-β-Gal染色、CCK8比色法、细胞周期及凋亡率检测的方法观察衰老大鼠体内BMSCs衰老生物学指标。7.应用SA-β-Gal染色、CFU-Mix混合集落检测、细胞周期检测的方法观察衰老大鼠体内BMNCs衰老生物学指标。8.人参皂苷Rgl注射衰老大鼠,分离纯化BMSCs及BMNCs后,应用SA-Gal染色、CCK8比色法、细胞周期及凋亡率检测、DCFH-DA荧光法检测胞内ROS含量,酶免疫法检测培养上清液中水平氧化损伤指标MDA、SOD、GSH-Px及细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、SCF、 Western blot检测胞内P53、P21、P16、CDK2及cyclinD表达水平的方法从衰老生物学指标、慢性炎症、氧化损伤及衰老蛋白表达的方面观察ggl拮抗衰老大鼠体内BMSCs衰老的机理。9.应用SA-Gal染色、CFU-Mix混合集落检测、细胞周期检测、DCFH-DA荧光法检测胞内ROS水平、WST-8检测胞内SOD活力、Western blot检测胞内P53、P16表达水平的方法,并结合之前的实验结果,从衰老生物学指标、慢性炎症、氧化损伤及衰老蛋白表达的角方面观察Rg1处理衰老大鼠后,体内BMNCs衰老延缓及其造血功能恢复的可能机理及其与BMSCs的关系。结果1.全骨髓贴壁培养纯化后的BMSCs,台盼蓝染色活细胞率为：(96±0.68)%,表明贴壁培养纯化后的BMSCs具有良好的生物学特点。2.D-gal作为致衰剂在体外能诱导BMSCs呈现典型的衰老生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率升高,透射电镜观察亚细胞结构表现典型衰老形态学特点：细胞质深染、线粒体空泡变性、细胞膜形态改变,CCK8检测细胞增殖能力减弱,细胞周期G1期增加、s期减少,细胞凋亡率增加,胞内SOD活力降低、ROS及MDA水平增加,激光共聚焦观察胞内ROS荧光强度明显增强,细胞上清液中IL-2、TNF-α升高,IL-6、SCF、GM-CSF、IL-1β降低,胞内P53、P21、P16表达水平升高,CDK2、CDK4及cyclinD表达减少,而cyclinE表达水平无明显改变。3.衰老BMSCs与BMNCs体外共培养,BMNCs呈现衰老的生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率升高,CFU-Mix形成能力减弱,CCK8检测细胞增殖能力减弱,细胞周期G1期增加、S期减少,细胞凋亡率增加,胞内SOD活力降低、ROS及MDA水平增加,激光共聚焦观察胞内ROS荧光强度明显增强。4.Rg1体外作用衰老BMSCs可降低其SA-β-Gal染色阳性细胞率,增加CCK8细胞增殖能力,降低透射电镜观察到细胞衰老形态学改变减轻,提升S期细胞率,降低G1期细胞,降低细胞凋亡率,提升胞内SOD活力、降低ROS及MDA水平,激光共聚焦观察胞内ROS荧光强度明显减弱,细胞上清液中IL-2、TNF-α减少,IL-6、SCF、GM-CSF、 IL-1β水平升高,胞内P53、P21、P16表达水平降低,CDK2、CDK4表达上升,cyclinD及cyclinE表达水平无明显改变。5.Rg1体外作用衰老BMSCs与BMNCs共培养后,与衰老组BMNCs比较,SA-β-Gal染色阳性细胞率降低,CFU-Mix形成能力增强,CCK8检测细胞增殖能力增强,细胞周期G1期减少、S期增加,细胞凋亡率减少,胞内SOD活力提升、ROS水平降低而MDA水平无明显改变,激光共聚焦观察胞内ROS荧光强度明显减弱。6.衰老大鼠BMSCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加、CCK8细胞增殖能力减弱、细胞周期S期细胞比例减少、G1期比例增加,凋亡率明显增加,胞内MDA水平升高GSH-Px水平降低、IL-2、TNF-α分泌水平减少、IL-6、SCF分泌水平增加,Western blot检测胞内P53、P21、P16增加,CDK2表达减少,而cyclinD水平无明显改变。7.衰老大鼠BMNCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加、CFU-Mix混合集落形成能力减弱、细胞周期S期细胞比例减少,G1期细胞比例增加,ROS水平增加、SOD活力降低、Western blot检测胞内P53、P16表达水平增加。8.Rgl作用衰老大鼠后,体内BMSCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率明显减少、CCK8细胞增殖能力增加、细胞周期S期细胞比例增加、G1期比例降低,凋亡率明显减少,ROS、MDA水平减少,SOD活力增加但GSH-Px水平无明显改变、IL-2、TNF-α分泌水平增加、IL-6、 SCF水平减少,Western blot检测胞内P53、P21、P16表达减少,CDK2与cyclinD水平无明显改变。9.Rg1作用衰老大鼠后,体内BMNCs的SA-β-Gal染色阳性细胞率明显减少、CFU-Mix混合集落形成能力增强、细胞周期S期细胞比例增加,G1期细胞比例减少,ROS水平减少、SOD活力增加、Western blot检测胞内P53、P16表达明显减少。结论1.D-gal可以复制BMSCs衰老的体内外模型。2.衰老的BMSCs可诱导BMNCs衰老。3.人参皂苷Rg1在体内外均可拮抗D-gal对BMSCs的致衰作用,并通过以上途径恢复BMNCs的造血能力。。4.人参皂苷Rg1拮抗D-gal对BMSC的致衰作用可能与抑制氧化应激损伤、抑制炎性反应、下调衰老相关蛋白有关。
【关键词】：人参皂苷Rg1 骨髓基质细胞 骨髓单个核细胞 D-半乳糖 衰老 拮抗衰老 机理
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-14
• 英文摘要14-24
• 第一部分：D-半乳糖体外诱导骨髓基质细胞衰老作用及机理研究24-45
• 前言24
• 1 材料与方法24-29
• 2 结果29-33
• 3 讨论33-35
• 4 结论35-36
• 5 参考文献36-38
• 附图38-45
• 第二部分：人参皂苷Rg1体外调控骨髓基质细胞衰老及机理研究45-65
• 前言45
• 1 材料与方法45-47
• 2 结果47-52
• 3 讨论52-54
• 4 结论54-55
• 5 参考文献55-58
• 附图58-65
• 第三部分：衰老大鼠骨髓基质细胞生物学及其与造血功能关系研究65-79
• 前言65
• 1 材料与方法65-66
• 2 结果66-70
• 3 讨论70-71
• 4 结论71
• 5 参考文献71-74
• 附图74-79
• 第四部分：人参皂苷Rg1对衰老大鼠骨髓基质细胞与造血功能的影响79-94
• 前言79
• 1 材料与方法79-80
• 2 结果80-84
• 3 讨论84-86
• 4 结论86
• 5 参考文献86-89
• 附图89-94
• 全文总结94-95
• 文献综述：造血微环境衰老的分子机制研究95-101
• 参考文献98-101
• 致谢101-102
• 攻读学位期间发表的学术论文102

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10 谢肖立;吴s，

本文编号：592503