菌毛及纳米材料对地杆菌胞外电子传递影响的研究

发布时间：2017-07-30 09:20

  本文关键词：菌毛及纳米材料对地杆菌胞外电子传递影响的研究

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【摘要】：产电菌(Electricigens)通过分解代谢有机物释放电子,电子通过结合于细胞内膜上的电子传递链传递并提供微生物代谢活动所需的能量,而电子最后通过一种被称作“胞外电子传递”(EET)的方式传递给环境中的电子受体。EET在环境的生物地理化学循环、生物电化学系统和生物修复等领域发挥着重要的作用并正成为学术界研究的热点。硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)是被人们广泛研究的一种土壤中广泛存在在严格厌氧细菌,其通过EET代谢环境中的电子受体并影响着土壤地质的组成与土壤的生物修复、构成了微生物燃料电池生物阳极优势菌种。G. sulfurreducens (Gs)代谢胞外电子受体需要多种物质的协作,比如细胞色素C、菌毛(Gs-pili)、土壤中的矿物等。本论文将分别从菌毛和纳米材料两个方面研究它们对EET的影响。Gs-pili是Gs完成胞外电子传递所必须的,然而对于其在EET过程中发挥的具体功能学术界还没有一个统一的结论,甚至于编码Gs-pili蛋白单体(Gs-PilA)的基因(Gs-pila)尚无明确的定义。本研究首先定位了Gs-pila并分析其开放阅读框结构。然后构建了Gs异源菌毛蛋白表达系统,并通过表达不同组成与结构的菌毛来研究菌毛对Gs胞外电子传递的影响。产电菌可以稳定地利用阳极作为电子受体并实现电能的输出,而阳极修饰可以显著地提高产电菌代谢阳极的能力。本论文选取石墨烯及其复合物来修饰阳极从而研究纳米材料对Gs阳极胞外电子传递的促进作用。具体工作内容如下：(1)使用组氨酸标签标记预测的Gs-pila,通过电镜免疫胶体金染色法证明组氨酸标签标记的蛋白参与了Gs-pili的组成从而定位了Gs-PilA编码基因。Gs-pila具有两个潜在的翻译起始密码子(ATG和TTG),可能形成两种Gs-PilA前体蛋白单体。通过分析仅表达单种Gs-PilA前体蛋白的突变株的Gs-pila的转录及相应表型,证明Gs-pila仅具有唯一的翻译起始密码子(ATG)。(2)构建可以表达Pseudomonas aeruginosa PAO1菌毛蛋白(PA-PilA)的Gs突变株(Gs-PA),证明了异源四型菌毛蛋白可以在Gs中表达并正确的组装同时发现Gs-PA胞外细胞色素C的分布没有改变。通过表征Gs-PA胞外电子受体代谢,研究P.aeruginosa PAO1菌毛(PA-Pili)对Gs胞外电子传递的影响。(3)改变Gs-PilA中芳香族氨基酸的数目或者标记细胞色素PpcA于Gs-PilA上,研究不同组成的Gs-PilA对Gs胞外电子传递的影响。同时,构建可以表达Geobacter metallireducen、 Geobacter uraniireducens、 Pelobacter carbinolicus四型菌毛蛋白及截短的G. uraniireducens和P.carbinolicus四型菌毛蛋白的Gs突变株以研究不同结构的菌毛对Gs胞外电子传递的影响。(4)Gs细胞色素C—OmcZ突变株(Gs-△OmcZ)不能稳定地代谢阳极。本研究使用石墨烯/血红素纳米复合物来仿生模拟天然的细胞色素C,证明通过其阳极修饰可以恢复Gs-△OmcZ稳定阳极胞外电子传递的能力。同时证明其可以作为一般的阳极修饰方式用于微生物燃料电池阳极性能的提高。
【关键词】：菌毛 胞外电子传递 硫还原地杆菌 微生物燃料电池 阳极修饰 纳米材料
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-46
• 1.1 地杆菌12-13
• 1.2 四型菌毛：结构与功能13-19
• 1.3 胞外电子传递19-24
• 1.3.1 胞外氧化铁代谢20-21
• 1.3.2 阳极代谢21-23
• 1.3.3 种间直接电子传递23-24
• 1.4 菌毛介导的胞外电子传递模型24-28
• 1.4.1 类金属导电模型25
• 1.4.2 电子跃迁模型25-27
• 1.4.3 Stepping stone模型27-28
• 1.5 导电菌毛模型28-32
• 1.5.1 菌毛单体模型28-29
• 1.5.2 菌毛模型29-32
• 1.6 纳米材料与胞外电子传递32-34
• 1.6.1 天然纳米粒子促进胞外电子传递32-33
• 1.6.2 纳米材料促进产电菌阳极代谢33-34
• 1.7 本论文主要研究工作34-36
• 参考文献36-46
• 第二章 菌毛蛋白基因定位与翻译起始密码子识别46-72
• 2.1 引言46-48
• 2.2 材料与方法48-59
• 2.2.1 试剂与仪器48-49
• 2.2.2 菌株与质粒49-50
• 2.2.3 基因操作与质粒构建50-53
• 2.2.4 构建转基因硫还原地杆菌53-55
• 2.2.5 培养基配置与细菌培养55-57
• 2.2.6 蛋白变性凝胶电泳和蛋白免疫印迹57-58
• 2.2.7 蛋白胶染色58
• 2.2.8 免疫金标记与透射电镜观察58
• 2.2.9 Ferrozine分析58-59
• 2.2.10 荧光实时定量PCR59
• 2.3 结果与讨论59-67
• 2.3.1 组氨酸标签标记菌毛蛋白基因60-63
• 2.3.1.1 基因组原位标记60-61
• 2.3.1.2 基因组非原位标记61-62
• 2.3.1.3 胞外氧化铁代谢62-63
• 2.3.2 菌毛蛋白翻译起始密码子分析63-67
• 2.3.2.1 地杆菌四型菌毛蛋白基因比对63-64
• 2.3.2.2 菌株pilA4和pilA5低水平转录GSU149664-65
• 2.3.2.3 菌株pilA4低水平表达菌毛蛋白65-67
• 2.4 本章小结67-69
• 参考文献69-72
• 第三章 构建表达绿脓杆菌菌毛蛋白硫还原地杆菌及对胞外电子传递的影响72-96
• 3.1 引言72-74
• 3.2 材料与方法74-85
• 3.2.1 试剂与仪器74
• 3.2.2 菌株与质粒74-76
• 3.2.3 基因操作与质粒构建76-78
• 3.2.4 构建转基因硫还原地杆菌78-79
• 3.2.5 培养基配置与细菌培养79-81
• 3.2.6 细菌阳极产电能力测试81
• 3.2.7 蛋白变性凝胶电泳和免疫印迹分析81-82
• 3.2.8 蛋白胶染色和血红素染色82-83
• 3.2.9 胶体金免疫分析与透射电镜观察83
• 3.2.10 细菌粘附性测试83
• 3.2.11 阳极生物膜激光共聚焦显微观察83-84
• 3.2.12 荧光实时定量PCR84
• 3.2.13 菌毛导电性测试84-85
• 3.2.14 Ferrozine分析85
• 3.3 结果与讨论85-91
• 3.3.1 Pa-PilA在DL1中表达与组装85-88
• 3.3.2 菌株PA表面细胞色素C组成与分布88-89
• 3.3.3 OmcS与PA-pili结合89
• 3.3.4 菌株PA胞外电子传递89-91
• 3.4 总结与展望91-93
• 参考文献93-96
• 第四章 菌毛组成与结构对硫还原地杆菌胞外电子传递的影响96-126
• 4.1 引言96-97
• 4.2 材料与方法97-112
• 4.2.1 试剂与仪器98
• 4.2.2 菌株与质粒98-104
• 4.2.3 基因操作与质粒构建104-109
• 4.2.4 转基因硫还原地杆菌构建与筛选109
• 4.2.5 培养基配置与细菌培养109
• 4.2.6 阳极代谢能力测试109-110
• 4.2.7 蛋白变性凝胶电泳和免疫印迹分析110
• 4.2.8 透射电镜观察110
• 4.2.9 Ferrozine分析110-111
• 4.2.10 荧光实时定量PCR111-112
• 4.3 结果与讨论112-122
• 4.3.1 菌毛蛋白芳香族氨基酸与胞外电子传递112-115
• 4.3.1.1 构建Gs-PilA芳香族氨基酸突变株112-113
• 4.3.1.2 菌毛蛋白芳香族氨基酸突变株胞外氧化铁还原113-115
• 4.3.2 增加菌毛细胞色素C含量对胞外电子传递的影响115-117
• 4.3.2.1 构建菌毛蛋白PgcA标记菌株115-116
• 4.3.2.2 菌株KN-PpcA氧化铁还原116-117
• 4.3.3 菌毛蛋白结构对胞外电子传递的影响117-122
• 4.3.3.1 不同结构菌毛蛋白的选择117-118
• 4.3.3.2 菌毛蛋白结构对菌株DL1胞外电子传递的影响118-120
• 4.3.3.3 菌毛蛋白结构对菌株KN400胞外电子传递的影响120-122
• 4.4 本章小结122-123
• 参考文献123-126
• 第五章 石墨烯/血红素纳米复合物促进细菌阳极胞外电子传递126-140
• 5.1 引言126-127
• 5.2 材料与方法127-130
• 5.2.1 试剂与仪器127-128
• 5.2.2 试剂与仪器128
• 5.2.3 电极修饰128
• 5.2.4 试剂与仪器128-129
• 5.2.5 半电池构建与阳极产电测试129
• 5.2.6 阳极电化学表征129-130
• 5.2.7 紫外吸收光谱和拉曼光谱130
• 5.3 结果和讨论130-135
• 5.3.1 石墨烯/血红素复合材料表征130-131
• 5.3.2 石墨烯/血红素复合物修饰阳极产电能力测试131-132
• 5.3.3 石墨烯/血红素复合物修饰阳极电化学表征132-134
• 5.3.4 石墨烯/血红素复合物修饰阳极促进Gs-ΔOmcZ代谢阳极134-135
• 5.4 本章小结135-137
• 参考文献137-140
• 第六章 总结与展望140-142
• 附录1142-143
• 附录2143-144
• 附录3144-145
• 发表论文145-146
• 致谢146-147

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本文编号：593517