香青兰黄酮成分的药代动力学特征及代谢机理研究

发布时间：2017-07-30 16:14

  本文关键词：香青兰黄酮成分的药代动力学特征及代谢机理研究

  更多相关文章： 香青兰总黄酮 葡萄糖醛酸结合位点 药代动力学 甲基化 UPLC-DAD-QTOF

【摘要】：香青兰在维吾尔医学和民间用于治疗冠心病及高血压等疾病。香青兰总黄酮是从维药香青兰中提取纯化制备的黄酮有效部位,具有抗氧化,抗心肌缺血,治疗冠心病,心绞痛的等作用。田蓟苷是香青兰总黄酮有效部位的主要的黄酮成分,是其有效成分之一,具有抗炎和降压作用。许多关于黄酮类化合物的临床前药代动力学研究的文献,表明黄酮的生物利用度差,一般来说,黄酮类化合物的吸收比较好,但是它们在肠道和肝脏内发生迅速而广泛的葡萄糖醛酸化代谢。大多数临床前研究忽略黄酮代谢物的药代动力学研究的重要性。目前我们发现有关香青兰的药理作用及临床应用方面的报道很多,而有关香青兰总黄酮体内暴露情况的研究报道却很少。本论文通过采用多种指标成分研究香青兰总黄酮的药代动力学以及黄酮代谢情况,包括葡萄糖醛酸苷的甲基化代谢,为中药黄酮类有效成分的药代动力学研究提供新的思路,丰富黄酮类化合的代谢途径,同时也为香青兰总黄酮的新药开发和剂型改进提供依据。一、UPLC-DAD-QTOF分析香青兰总黄酮有效部位在大鼠体内的黄酮代谢轮廓采用UPLC-DAD-QTOF的方法,指认了香青兰黄酮有效部位中的15个黄酮成分；其主要是黄酮类(flavones),其基本结果如图a,如acacetin(Aca),apigenin (Api), luteolin (Lut), diosmetin (Dio)及其葡萄糖苷或葡萄糖醛酸苷。这些黄酮化合物都含有两个以上的酚羟基,主要有5-,7-,3’-和4’-羟基。Tilianin (Til), luteolin 7-glucuronide (Lut-7-G), apigenin 7-glucuronide (Api-7-G), acacetin 7-glucuronide (Aca-7-G), Api, Aca, luteolin 7-glucoside (Lut-7-Glc),Lut和Dio在香青兰总黄酮中被指认,其含量分别是7.3%,3.8%,1.1%,1.0%,0.089%,0.17%,0.45%,0.14%和0.30%(w/w)。在总黄酮中含量最高的是刺槐素的糖苷(Til和Aca-7-G),其次是木犀草素的糖苷(Lut-7-G和Lut-7-Glc)和芹菜素的糖苷(Api-7-G).该有效部位的黄酮类化合物主要是具有多个酚羟基的黄酮类,为阐述清楚口服给予香青兰总黄酮有效部位的血浆黄酮代谢轮廓图,建立了联合多种方法鉴别葡萄糖醛酸苷结合位点的策略,包括黄酮苷的的高分辨率质谱的测定以及柱后添加金属络合试剂CoBr2和辅助配体(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)形成的络合物[Co(Ⅱ)(黄酮苷-H)(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)2]+质谱分析和与酶合成的黄酮葡萄糖醛酸苷的对照品(葡萄糖醛酸结合位点通过UV光谱漂移的方法鉴别)的保留时间比对,判别血浆中黄酮葡萄糖醛酸苷的结合位点。该策略成功应用于灌胃给予香青兰总黄酮有效部位的血浆黄酮代谢轮廓图研究,鉴别血浆中不同取代位置的葡萄糖醛酸黄酮苷12个,分别是Aca, Api, Lut, Dio, chrysoeriol(Chr)和cirsimaritin(Cir)的单葡萄糖醛酸苷。即Aca-7-G, Aca-5-G, Api-5-G, Api-7-G, Lut-7-G, Lut-3'-G, Lut-4'-G, Dio-7-G, Dio-3'-G, Chr-4'-G, Cir-4'-G和Dio-5-G/Chr-5-G。首次建立的香青兰总黄酮在体内的黄酮代谢轮廓图,鉴定24个黄酮化合物,其中入血成分10个,14个黄酮代谢产物。在体内黄酮结构上3’-和7-的羟基易与葡萄糖醛酸结合成苷。根据灌胃给予香青兰总黄酮有效部位的血浆黄酮代谢轮廓图和香青兰总黄酮中主要黄酮的含量,选择Til, Aca-7-G, Lut-3'-G, Api-7-G,Api和Aca六个黄酮成分为香青兰总黄酮有效部位SD大鼠口服药代动力学的pharmacokinetic markers..二、香青兰总黄酮有效部位在大鼠体内的药代动力学研究建立了同时检测血浆中Til, Aca-7-G, Lut-3'-G, Api-7-G, Api和Aca的UPLC-MS/MS的定量分析方法,采用甲醇从血浆中提取待分析化合物,除去血浆中的蛋白。色谱柱为BEH C18柱(1.7μm,50mm×2.1 mm),流动相为乙腈(B)-0.5 mM乙酸铵水溶液(A)。洗脱梯度：0-1 min,5-5% B,1-1.5 min,5-10% B, 1.5-5 min,10-21% B,5-6 min,21-21% B,6-8 min,21-90% B,8-10 min,90% B,10-10.5 min,90-5% B;流速为0.3 mL/min。应用该方法研究了香青兰总黄酮有效部位在大鼠体内的药代动力学,绘制了灌胃给予400 mg/kg,200 mg/kg和100 mg/kg的三个剂量组的SD大鼠血浆药物浓度-时间曲线,采用非房室模型计算主要的药代动力学参数(Winnolin 3.3),评价SD大鼠给药后香青兰黄酮在体内的动力特征,Til, Aca-7-G, Api-7-G, Api和Aca快速被吸收,Aca-7-G在血浆中的暴露量大于其他黄酮苷的,其次是Lut-3'-G;而香青兰总黄酮有效部位中的较多的Lut-7-G,在血浆中很少,而以Lut-3'-G暴露。香青兰总黄酮药动学呈非线性动力学特征。这可能是由于香青兰总黄酮给药剂量达到一定限度时,体内Ⅱ相代谢酶的催化能力和转运蛋白的转运能力达到饱和,血药浓度的变化不呈现剂量依赖性。SD大鼠灌胃给药后的Til绝对生物利用度在高、中、低三个剂量组分别平均为1.63%,0.45%,0.24%。三、Tilianin在大鼠体内的药代动力学研究建立了同时检测血浆中Til, Aca-7-G, acacetin-7-sulfate (Aca-7-S)和Aca的UPLC-MS/MS的定量分析方法,符合生物的样品分析方法验证的要求,采用甲醇从血浆中提取待分析化合物,除去血浆中的蛋白。色谱柱为BEH C18柱(1.7μm,50 mm×2.1 mm),流动相为乙腈(B)-0.5 mM乙酸铵水溶液(A)。洗脱梯度：0-1 min,5-5% B,1-1.5 min,5-10% B,1.5-5 min,10-21% B,5-6 min, 21-21% B,6-8 min,21-90% B,8-9 min,90% B,9-9.5 min,90-5% B;流速为0.3 mL/min。应用该方法研究了香青兰总黄酮有效部位中含量最多的成分——Til在大鼠体内的药代动力学。绘制了灌胃给予30 mg/kg和15 mg/kg的两个剂量组和尾静脉给药组(0.3 mg/kg)的SD大鼠血浆药物浓度-时间曲线,采用非房室模型计算主要的药代动力学参数(Winnolin 3.3),评价SD大鼠给药后Til,Aca-7-G, Aca-7-S和Aca在体内的动力学特征。Til和Aca在血浆中浓度比较低,而血浆中主要代谢物Aca-7-G和Aca-7-S的血药浓度比较高,约9h达峰;而Aca-7-G在香青兰总黄酮有效部位的药代动力学研究中,达峰时间为20 min,达峰时间显著的差异(P0.05),这个现象可能与Til, Aca和Aca-7-G在体内的三个循环(即肝肠循环,肠肠循环和肠局部循环)有关。采用灌胃给予Aca(10mg/kg)后,Aca-7-G的达峰时间也在9h左右,也验证了三个循环导致大量的Aca-7-G外排至肠腔,随肠道蠕动至结肠,被细菌水解成Aca,再次被吸收代谢成Aca-7-G入血。四、Luteolin 7-glucuronide的甲基化代谢研究采用鼠肝S9的孵育体系研究Lut-7-G的甲基化代谢,其中S9是儿茶酚-O-甲基转移酶的酶源,S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,反应在37℃的磷酸盐缓冲液(5 mM,pH 7.8)中进行,一段时间后加入冰冷含内标的甲醇溶液终止反应。Lut-7-G在体外的甲基化反应体系中,产生了两个甲基化产物,通过QTOF的鉴别分别是Dio-7-G和Chr-7-G。Lut和Lut-7-G在三不同浓度(1,5和10μM)甲基化速率比较中,都倾向于4’位即对位甲基化,在鼠肝S9中,Lut-7-G更容易甲基化生成Dio-7-G,而其甲基化速率比Lut的甲基化速率慢(P0.05),且约为Lut甲基化速率的1/2-2/3。使用鼠肝微粒UGT孵育体系研究Dio和Chr的葡萄糖醛酸化代谢(对于Dio底物浓度范围选择0.3125-80 μM,孵育时间30 min；对于Chr底物浓度范围选择0.3125-15μM,孵育时间30 min),采用米氏方程或其他方程拟合,发现3’和4’易于被UGT代谢。在胆道插管大鼠实验中,灌胃给予Lut (4.7mg/kg)之后,通过插管收集胆汁,采用UPLC-MS/MS分析,发现胆汁中存在大量的Lut-3'-G, Lut-7-G, Chr-7-G和Dio-7-G而Chr-4'-G和Dio-3'-G未检测到。由可知此体内的Chr-7-G和Dio-7-G可能不是由Lut先被甲基化,生成Dio和Chr,然后再葡萄糖醛酸化产生,而是主要由Lut先被葡萄糖醛酸化生成Lut-7-G,然后甲基化生成。因此甲基化代谢可能是机体处置儿茶酚类葡萄糖醛酸苷的一种重要代谢途径。结论：本文首次采用联合多种鉴别黄酮葡萄糖醛酸苷结合位点方法的策略,分析灌胃给予香青兰总黄酮有效部位的血浆黄酮代谢轮廓,成功地鉴别血浆中不同取代位置的葡萄糖醛酸黄酮苷12个。首次建立香青兰总黄酮在体内的黄酮代谢轮廓图,鉴定24个黄酮化合物,其中入血成分10个,14个黄酮代谢产物。在体内黄酮结构上3’-和7-的羟基易与葡萄糖醛酸结合成苷。将灌胃给予香青兰总黄酮有效部位的血浆黄酮代谢轮廓图,应用于香青兰黄酮在大鼠体内药代动力学研究,考察了Til, Aca-7-G, Lut-3'-G, Api-7-G, Api和Aca在大鼠体内的药物动力学特征,发现Til在大鼠的生物利用度低,但是香青兰总黄酮中的Til的生物利用度比纯品的生物利用度高,血浆中暴露的Aca-7-G和Lut-3'-G较其他黄酮苷多,香青兰总黄酮药动学呈非线性动力学特征。本文通过Til在大鼠体内药代动力学研究,考察了Til, Aca-7-G, Aca-7-S和Aca,在大鼠体内的药物动力学特征。发现Aca-7-G在香青兰总黄酮给药组中的达峰时间显著小于Til给药组中的达峰时间,这个现象可能与Til, Aca和Aca-7-G在体内的肝肠循环,肠肠循环和肠局部循环有关。体外首次证实Lut-7-G可甲基化生成Chr-7-G和Dio-7-G。阐释了甲基化代谢可能是机体处置儿茶酚类葡萄糖醛酸苷的一种重要代谢途径。
【关键词】：香青兰总黄酮 葡萄糖醛酸结合位点 药代动力学 甲基化 UPLC-DAD-QTOF
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R29
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 前言20-36
• 1.1 香青兰的药理作用21-23
• 1.1.1 抗氧化作用21
• 1.1.2 对血液流变性和血小板的作用21
• 1.1.3 降血脂21
• 1.1.4 抗动脉粥样硬化和对缺血心肌的保护作用21-23
• 1.1.5 对脑的保护作用23
• 1.1.6 其他23
• 1.2 香青兰中的黄酮成分23-25
• 1.3 黄酮的药代动力学中的葡萄糖醛酸苷的结合位点的判断25-29
• 1.4 黄酮的代谢研究29-36
• 1.4.1 黄酮类化合物的Ⅰ相代谢31
• 1.4.2 黄酮类化合物的Ⅱ相代谢31-32
• 1.4.3 黄酮类化合物的其他代谢32-34
• 1.4.4 参与黄酮类化合物结合反应的葡萄糖醛酸转移酶、磺酸转移酶和儿茶酚氧位甲基转移酶34-36
• 第二章 立题依据和意义36-38
• 第三章 UPLC-DAD-QTOF分析香青兰总黄酮有效部位在大鼠体内的黄酮代谢轮廓38-65
• 3.1 材料与仪器39-41
• 3.1.1 材料39-40
• 3.1.2 仪器40-41
• 3.1.3 动物41
• 3.2 方法41-47
• 3.2.1 UPLC-Q-TOF鉴别香青兰提取物中的黄酮类成分及其定量分析41-43
• 3.2.2 建立一种联合多种方法的策略应用于辨别生物样品中黄酮葡萄糖醛酸苷的同分异构体43-47
• 3.2.3 黄酮葡萄糖醛酸苷在血浆中的相对丰度47
• 3.3 结果与分析47-63
• 3.3.1 香青兰总黄酮有效部位中的黄酮类成分的指认及其定量分析47-50
• 3.3.2 UPLC-DAD-QTOF分析香青兰总黄酮有效部位在大鼠体内的代谢轮廓研究50-63
• 3.4 讨论与结论63-65
• 第四章 香青兰总黄酮有效部位在大鼠体内的药代动力学研究65-85
• 4.1 材料与仪器65-67
• 4.1.1 材料65-66
• 4.1.2 仪器66-67
• 4.1.3 动物67
• 4.2 方法67-71
• 4.2.1 建立一个同时检测6种黄酮的UPLC-MS/MS方法67-69
• 4.2.2 Aca-7-G的浓度的测定69-70
• 4.2.3 UPLC-MS/MS方法的验证70-71
• 4.2.4 香青兰总黄酮药代动力学研究71
• 4.3 结果与分析71-83
• 4.3.1 Aca-7-G质谱光谱的鉴定和转化因子的测定71-72
• 4.3.2 UPLC-MS/MS方法学验证72-78
• 4.3.3 香青兰总黄酮有效部位药代动力学研究78-83
• 4.4 讨论与结论83-85
• 第五章 Tilianin在大鼠体内的药代药动学研究85-103
• 5.1 材料与仪器85-87
• 5.1.1 材料85-86
• 5.1.2 仪器86
• 5.1.3 动物86-87
• 5.2 方法87-90
• 5.2.1 Acacetin-7-sulfate(Aca-7-S)的制备87
• 5.2.2 建立一个同时检测Til及主要代谢物的UPLC-MS/MS方法87-88
• 5.2.3 Til在大鼠体内的药代动力学88-89
• 5.2.4 刺槐素的药代动力学研究89-90
• 5.3 结果与分析90-100
• 5.3.1 Aca-7-S的鉴定及转化因子的测定90-91
• 5.3.2 Til的药代动力学研究91-94
• 5.3.3 Aca在大鼠体内的药代动力学研究94-100
• 5.4 讨论和结论100-103
• 第六章 Luteolin 7-glucuronide的甲基化代谢103-123
• 6.1 材料与仪器103-105
• 6.1.1 材料103-104
• 6.1.2 仪器104-105
• 6.1.3 动物105
• 6.2. 方法105-110
• 6.2.1 实验准备105
• 6.2.2 Lut-7-G在大鼠肝S9中甲基化代谢105-106
• 6.2.3 Dio和Chr葡萄糖醛酸代谢物的浓度转化因子106-108
• 6.2.4 酶动力学分析108
• 6.2.5 大鼠肝微粒体(RLM)对Dio和Chr的UGT代谢研究108-109
• 6.2.6 采用胆道插管大鼠模型研究Lut在肝脏中的代谢109
• 6.2.7 数据处理109-110
• 6.3 结果与分析110-121
• 6.3.1 Lut-7-G在大鼠肝S9中甲基化代谢孵育代谢产物的鉴定110-112
• 6.3.2 Lut和Lut-7-G在大鼠肝S9中甲基化的速率比较112-113
• 6.3.3 Lut-7-G在大鼠肝S9中的酶动力学研究113-114
• 6.3.4 大鼠肝微粒体对香叶木素和金圣草素的UGT代谢代动力学研究114-117
• 6.3.5 Lut在肝脏中的代谢117-121
• 6.4 讨论和结论121-123
• 第七章 结论123-126
• 参考文献126-139
• 缩写词简表139-141
• 致谢141-142
• 博士研究生期间发表论文情况142-143
• 附录143-145
• 统计学审稿证明145

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本文编号：595069