乙醛脱氢酶2对代谢综合征小鼠心肌的保护作用及机制研究

发布时间：2017-08-01 07:12

  本文关键词：乙醛脱氢酶2对代谢综合征小鼠心肌的保护作用及机制研究

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【摘要】：研究背景目前,心脑血管病已经在发展中国家开始蔓延,成为世界首位的死亡原因,严重地危害着人类的生命和健康,而心力衰竭作为各种心脏病发展的严重阶段,正在成为本世纪最重要的心血管病症。有流行病学资料显示,全球心衰患者的数量以每年约200万的速度递增,并且心衰的病死率高,5年存活率与恶性肿瘤接近。现已明确,各种原因引起的心肌重构是导致心衰发生发展的基本病理生理基础。心肌重构是由一系列复杂的分子及细胞机制导致的心肌结构、功能和表型的变化。其心肌生物学特征改变包括：心肌细胞凋亡；病理性心肌细胞肥大；心肌细胞外基质降解增加或过度纤维化。其心脏几何学特征改变为：心肌重量和心室容量的增加；心室形状的改变；心脏结构和功能的改变,最终导致心功能失代偿,即心力衰竭。临床多种疾病均可导致心肌重构,如高血压、糖尿病、肥胖、冠心病、瓣膜病等。近年来,肥胖及糖、脂代谢紊乱等非血流动力学因素对心脏结构和功能的作用日益受到重视。代谢综合征(Metabolic syndrome, MS)为肥胖、血脂紊乱、高血压、血糖调节受损或胰岛素抵抗等多种心血管疾病危险因素的簇集。MS及其各组分均可对心脏结构及功能造成显著的影响,其中以左心室结构改变为最早期和最突出的表现,有研究表明,左室结构改变是心脏病患者病死率上升的独立危险因素。目前,MS在我国发病率逐年上升,因此,防治MS心肌重构已成为治疗的首要目标。预防MS所致心肌损伤、延缓左室重构,可改善心力衰竭的长期临床预后。乙醛脱氢酶2 (Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)是线粒体内一种重要的醛类氧化酶,能够将各种外源性和内源性醛类物质转化为相应的酸,减少醛类物质导致的细胞损伤。研究表明,心脏缺血-再灌注损伤过程中,ALDH2活性与心肌梗死面积高度负相关,提示ALDH2具有重要的心肌保护作用；另有研究显示,ALDH2可通过代谢4-HNE等毒性醛类而在心肌梗死过程中起到抗心肌细胞凋亡并改善心室重构的作用。尽管国内外学者在ALDH2心肌保护方面开展了部分研究,但MS导致的心肌损伤、重构是否与ALDH2的表达和活性抑制有关,过表达ALDH2是否可以起到MS心肌的保护作用,其作用是否与调控JNK/AP-1有关,迄今未见报道。因此,我们推测：MS导致的心肌损伤重构过程与内源性ALDH2表达和活性的下降有关,过表达或增强ALDH2舌性可以起到干预MS心肌重构,改善心功能,进而起到MS心肌的保护作用,其作用机制可能与ALDH2减轻氧化应激,调控JNK/AP-1表达,改善胰岛素抵抗,减少心肌细胞凋亡及心肌间质纤维化有关。本课题立足于ALDH2与MS心肌保护之间存在着密切关系,以心肌细胞凋亡和心肌间质纤维化为切入点,我们采用高脂饮食诱导MS小鼠模型,超声和组织学检测评价心脏结构与功能异常,明确MS小鼠心肌ALDH2活性与心功能的关系；过表达ALDH2,进而探讨ALDH2对MS小鼠心肌重构发展过程中JNK/AP-1及心肌细胞凋亡、心肌间质纤维化等重要因子表达的影响,不仅有助于阐明ALDH2干预MS心肌重构的内在分子机制,而且可以为该酶靶点的心肌保护作用提供新的思路和治疗策略。研究目的1.高脂饮食诱导MS小鼠心肌重构,评价MS小鼠心肌重构的特征改变；2.观察MS小鼠心肌ALDH2表达及活性变化趋势,探讨ALDH2活性是否与心功能EF值呈正相关；3.评价ALDH2对MS小鼠心肌细胞凋亡及心肌纤维化的影响,探讨ALDH2对MS小鼠心肌结构和功能的保护作用；4.探讨ALDH2干预MS小鼠心肌重构的具体分子作用机制,为临床干预MS心肌重构提供新的治疗靶点。研究方法高脂饮食诱导建立MS小鼠模型：将90只雄性C57 BL/6J小鼠随机分为正常对照组(NC组,n=15只)和模型组(n=75只)。NC组以标准饲料喂养；模型组以高脂饲料喂养。饲料具体配方构成比为基础料61%,猪油27.5%,酪蛋白8.5%,胆固醇1.2%,胆酸钠0.2%,磷酸氢钙0.6%,石粉0.6%,添加剂0.4%。喂养10周后将造模成功的55只MS小鼠随机分为三组：MS组(n=15只),继续以高脂喂养；ALDH2载体组(n=20只),继续高脂喂养,并左心室注射ALDH2慢病毒载体；GFP组(n=20只),继续高脂喂养,并左心室注射不携带ALDH2重组基因的GFP载体。转染慢病毒载体4周后,处死动物,留取心脏组织备用。实验过程中进行以下指标监测：(1)每2周应用电子秤测量小鼠体重。(2)小鼠开始喂养前、喂养10周及转染病毒载体4周后,检测血清总胆固醇(Total cholesterol、甘油三酯(Triglycerides、低密度脂蛋白胆固醇(LoWdensity lipoprotein-cholesterol, LDL-C)、空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)以及胰岛素(Fasting blood insulin, FINS),并计算稳态模型胰岛素抵抗评价指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR, HOMA-IR= FBG×FINS/22.5)o(3)小鼠开始喂养10周及转染载体4周后,应用高分辨显微超声仪测量小鼠舒张末期左室内径(Left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、收缩末期内径(Left ventricular end systolic diameter, LVESD),并计算左室质量(left ventricular mass, LVM)、射血分数(Ejection fraction, EF)及左室短轴缩短率(Left ventricular short axis reduced rates, FS)。实验结束时处死动物,留取心脏标本,进行下列实验：(1)分光光度法测定线粒体ALDH2活性。(2)透射电镜检测小鼠心肌超微结构；心肌组织病理学检测(HE染色、Masson染色)心肌结构及心肌纤维化。(3) TUNEL法检测左室心肌细胞的凋亡率；JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。(4)DCF法检测心肌细胞内ROS的水平。(5)免疫组化染色检测心肌组织4-HNE含量。(6)实时定量RT-PCR法检测TGF-β1、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ mRNA表达,β-actin基因用作内参基因。(7) Western blot法检测p-JNK、AP-1、p-IRS-1(Ser 307)、IRS-1、p-AKT、 AKT、caspase-3以及ALDH2蛋白表达,(3-actin作为内参进行定量分析。统计学分析：所有实验数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS17.0统计软件对资料进行分析。两组间比较采用独立样本t检验,干预前后比较采用配对t检验；三组以上比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多组间两两比较采用LSD (Least significant difference)检验；各指标间相关分析采用Pearson相关。以P0.05为差异有统计学意义。研究结果1.MS小鼠模型成功建立在模型建立过程中,模型组小鼠共死亡5只,并剔除不符合MS标准的小鼠后,最终55只成模,正常对照组无死亡。转染后,ALDH2载体组及GFP组各死亡6只,阳性对照组死亡1只,最终共57只小鼠完成实验：NC组(n=15只),MS组(n=14只),ALDH2载体组(n=14只),GFP组(n=14只)。C57 BL/6J小鼠高饲喂养10周后,表现出明显的MS特征。与NC组比较,模型组小鼠体重增加,血清TC、TG、LDL-C、FBG及FINS增高,计算HOMA-IR升高,差异有统计学意义(P0.05)。表明经10周高饲喂养,已成功建立了MS小鼠模型。2. ALDH2转染后有效改善MS小鼠各项代谢指标及体重转染ALDH2慢病毒载体4周后,与MS组及GFP组比较,ALDH2载体组血清FBG、FINS水平下降,计算HOMA-IR降低,差异有统计学意义(P0.01)；体重、TG、TC、LDL-C有所下降,差异有统计学意义(P0.05)。3.各组小鼠心肌ALDH2活性及蛋白表达的变化与NC组小鼠比较,MS组小鼠心肌线粒体ALDH2活性明显下降(P0.01)；其ALDH2活性下降约40%；与NC组小鼠比较,MS组小鼠ALDH2蛋白表达降低(P0.01)。转染ALDH2'慢病毒载体后,小鼠心肌ALDH2蛋白表达及活性明显升高(P0.01)。4.转染ALDH2慢病毒载体对MS小鼠心肌氧化应激指标的影响MS组小鼠心肌细胞内ROS水平显著高于NC组小鼠(P0.01),而ALDH2组小鼠心肌细胞内ROS水平较MS组降低,但无统计学差异(P0.05)。4-HNE免疫组织化学染色结果显示,MS组小鼠心肌4-HNE含量高于NC组小鼠(P0.01)；与MS组和GFP组相比较,ALDH2组小鼠4-HNE含量明显下降(P0.01)。提示ALDH2舌性及蛋白表达增高,可有效清除4-HNE,进而改善小鼠心肌氧化应激状态。5. ALDH2转染后有效改善MS小鼠心脏结构和功能与NC组相比,MS组小鼠LVEDD及LVESD 显著增加(P0.01),EF及FS显著下降(P0.01)。与MS组和GFP组相比,ALDH2组小鼠LVEDD及LVESD显著下降,且EF及FS显著提高(P0.05)。6. ALDH2转染后有效改善MS小鼠心肌形态学、超微结构HE染色结果显示,与NC组比较,MS组小鼠心肌细胞排列紊乱,可见肌纤维断裂。与MS组及GFP组比较,ALDH2载体组心肌结构紊乱有所改善。透射电镜结果显示,NC组可见肌纤维沿长轴整齐排列,肌小节及明暗带清晰规则：线粒体丰富,大小较一致；细胞间质可见成纤维细胞和少量胶原纤维。MS组及GFP组肌纤维排列紊乱,Z线消失明显；胞浆内质网肿胀,线粒体肿胀、空泡化,自噬体出现,可见凋亡小体；间质充满增生的胶原纤维,胶原纤维走形紊乱,断裂。与MS组及GFP组相比,ALDH2组肌纤维的排列较为整齐,线粒体肿胀、空泡化明显改善；胶原纤维明显减少,排列相对整齐。7. ALDH2转染后可通过调控JNK/AP-1表达,影响IRS-1/AKT/caspase3通路以减少心肌细胞凋亡TUNEL.染色阳性的细胞即为凋亡细胞,细胞核可被染色为棕褐色或棕黄色的颗粒。TUNEL染色阳性细胞在NC组小鼠心肌细胞中数量极少,而在MS组小鼠心肌细胞中明显增多,有显著性差异(P0.01)；与MS组及GFP组相比,ALDH2组TUNEL染色阳性细胞明显减少,有显著性差异(P0.01)。JC-1检测线粒体膜电位变化：与NC组比较,MS组及GFP组小鼠线粒体膜电位明显下降(P0.01)。与MS组及GFP组比较,ALDH2组线粒体膜电位升高(P0.05)。Western blot法检测重要因子蛋白表达：与NC组比较,MS组及GFP组p-JNK、AP-1、p-IRS-1 (Ser 307)、IRS-1、caspase-3蛋白表达升高,p-AKT/AKT蛋白表达下降,差异均有统计学意义(P0.05)；与MS组及GFP组比较,ALDH2组p-JNK、AP-1、-IRS-1(Ser 307)、caspase-3蛋白表达下降,p-AKT/ AKT蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P0.05)。8. ALDH2转染后可通过调控JNK/AP-1表达,进而通过抑制TGF-β1/胶原合成以减少心肌纤维化Masson染色结果显示,NC组的心肌间质胶原组织排列整齐,分布较均匀；与NC组相比,MS组和GFP组胶原纤维明显增多,围绕心肌细胞的胶原纤维排列紊乱甚至断裂；与MS组及GFP组相比,ALDH2组胶原纤维则明显减少,排列较规则整齐。胶原定量分析显示：MS组心肌CVF升高,胶原相对含量较NC组明显增多(P0.01); ALDH2组胶原相对含量较MS组明显减少(P0.05)。RT-PCR检测TGF-p1、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ mRNA表达：与NC组比较,MS组及GFP组小鼠心肌TGF-β1、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ mRNA表达均上调,差异有统计学意义(P0.01)；与MS组及GFP组比较,ALDH2载体组小鼠心肌TGF-β1、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ mRNA表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。研究结论(1)通过高脂饮食喂养C57 BL/6小鼠可诱导与人类MS相类似的MS模型。该模型存在左室结构改变、心肌细胞凋亡增多、心肌间质纤维化等心肌重构特征,为本研究提供了可靠的动物模型。(2)MS小鼠心肌重构过程中ALDH2表达及活性均下降,ALDH2活性与心功能EF值呈明显正相关。(3) ALDH2可通过清除4-HNE,改善胰岛素抵抗,起到保护MS小鼠心脏结构和功能的作用。(4) ALDH2可通过调控JNK/AP-1,影响IRS-1/AKT/caspase3表达,减少心肌细胞凋亡,延缓心肌重构,改善心脏功能。(5) ALDH2可通过调控JNK/AP-1,抑制TGF-β1/胶原合成,减少心肌纤维化,改善心肌重构。因此,本研究为MS小鼠心肌重构的干预治疗的提供了一种新思路、新策略。
【关键词】：代谢综合征 乙醛脱氢酶2 心肌重构 细胞凋亡 心肌纤维化
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符号说明21-23
• 第一部分 代谢综合征小鼠心肌ALDH2活性与心功能的关系23-60
• 前言23-24
• 1.材料与方法24-36
• 2.结果36-38
• 3.讨论38-42
• 4.结论42-43
• 附表43-48
• 附图48-53
• 参考文献53-60
• 第二部 ALDH2对代谢综合征小鼠心肌结构和功能的保护作用60-103
• 前言60-61
• 1.材料与方法61-74
• 2.结果74-75
• 3.讨论75-84
• 4.结论84-85
• 附图85-94
• 参考文献94-103
• 第三部分 ALDH2干预MS小鼠心肌重构的分子机制研究103-134
• 前言103-104
• 1.材料与方法104-111
• 2.结果111-112
• 3.讨论112-121
• 4.结论121-122
• 附图122-126
• 参考文献126-134
• 致谢134-135
• 攻读学位期间发表的学术论文目录135-136
• 附件136-137
• 英文论文Ⅰ137-166
• 英文论文Ⅱ166-188

【参考文献】

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1 汪R，

本文编号：603022