大鼠脑缺血—再灌注损伤时SGK1信号途径在海马神经元保护的机制研究

发布时间：2017-08-14 07:14

  本文关键词：大鼠脑缺血—再灌注损伤时SGK1信号途径在海马神经元保护的机制研究

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【摘要】：目的：本课题采用体内与体外相结合的实验设计,研究大鼠脑缺血-再灌注损伤时SGK1信号途径在海马神经元保护中的病理生理作用,旨在阐明SGK1信号途径在脑缺血-再灌注损伤时大鼠海马神经元保护中的作用机制。方法：采用1日龄SD大鼠的海马神经细胞,通过对海马神经细胞的培养,以海马神经元特异性抗MAP2抗体免疫荧光反应检测海马神经元细胞培养的结果；对海马神经元细胞进行了2小时的氧糖剥夺实验而建立氧糖剥夺海马神经细胞模型,以Annexin V FITC/PI流式细胞术检测不同处理组大鼠海马神经元的凋亡改变,应用Western blot技术检测不同细胞分组中SGK1的的表达；以pLV-IRES-DsRed为载体,构建SGK1过表达慢病毒载体,通过过表达SGK1慢病毒载体对不同细胞分组进行感染,提取总RNA,然后再进行逆转录,以荧光定量PCR技术检测SGK1慢病毒载体在不同细胞组中RNA表达的消长变化；通过提取不同细胞组中的总蛋白,并通过Western blot技术检测SGK1蛋白的表达,为了进一步检测SGK1在蛋白水平的过表达调控细胞凋亡的模式,我们采用PI3K抑制剂LY294002对细胞进行干预,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的数据变化。为揭示体内SGK1表达对神经细胞是否存在保护作用,我们构建了SD大鼠脑缺血-再灌注损伤模型,并于建模前的两周进行SGK1慢性病毒过表达质粒的注射,建模前15分钟时进行PI3K抑制剂LY294002预处理,此后,分别观察神经元凋亡SGK1及其他相关基因的蛋白表达变化；基于组织免疫荧光技术检测了脑缺血-再灌注(I/R)对整个大鼠脑部的损伤的范围和程度进行了分析和评估。结果：对体外培养的神经细胞进行120分钟的氧糖剥夺,构建氧糖剥夺神经细胞模型,和正常组相比,细胞凋亡数量存在显著差异(P0.01)；在对氧糖剥夺神经细胞进行10分钟、30分钟和60分钟的缺血后恢复发现神经细胞凋亡数量呈现逐渐增加趋势,且每组均和正常者存在显著差异(P0.01),而SGK1的表达量则是逐渐下降,和正常组之间均有显著差异(P0.01),提示SGK1可能对氧糖剥夺再恢复造成的神经细胞损伤有一定的抗损伤作用；通过构建SGK1过表达质粒,并对细胞进行处理,我们发现,和空载体组相比,在120分钟氧糖剥夺组和60分钟氧糖恢复组,SGK1过表达组细胞凋亡数量相对空载体组明显减少,与空载体组之间具有显著差异(P0.01),提示SGK1的表达对氧糖剥夺再供应组具有保护作用；通过PI3K抑制剂LY294002对氧糖剥夺120分钟后进行60分钟的恢复供应组进行SGK1过表达组进行LY294002预处理,与正常组相比,经LY294002处理的SGK1过表达组细胞凋亡数量和未处理组之间具有显著差异(P0.01),证明SGK1的表达在一定程度上系通过PI3K/Akt/GSK3 β信号通路介导的。我们通过大脑中动脉线栓法构建了SD大鼠脑缺血再灌注模型,并重复了上述实验,我们在构建的动物模型中重复得到了和细胞实验相一致的结果。我们细胞实验和动物模型实验均证实了：随着神经细胞氧糖供应不足,神经细胞会出现凋亡的趋势,而SGK1的表达则呈现下降趋势；通过构建的SGK1过表达质粒对实验组进行处理发现,SGK1的过表达可以显著的减少神经细胞凋亡的数量,提示SGK1的表达可以对神经细胞因氧糖供应不足导致的细胞凋亡起到一定的抗凋亡作用；而通过对氧糖剥夺的SD大鼠海马神经元细胞模型及脑缺血SD大鼠模型进行的PI3K抑制剂LY294002处理发现,SGK1蛋白的过表达受到抑制,而因SGK1过表达受到抑制的相关蛋白的表达也得以逆转,提示SGK1调控神经元细胞凋亡的信号途径且与PI3K/Akt/GSK3 β通路有关。结论：①SGK1的表达可以有效的减少氧糖剥夺SD大鼠海马神经元细胞及脑缺血-再灌注大鼠导致的神经元细胞的凋亡；②缺血-再灌注损伤时SGK1信号途径在大鼠海马神经元的保护中具有重要作用；③SGK1调控神经元细胞凋亡的分子机制与PI3K/Akt/GSK3β信号通路的激活有关。
【关键词】：海马 氧糖剥夺 脑缺血-再灌注 SGK1 信号转导 凋亡 大鼠
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 英文缩写词表7-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-12
• 序言12-17
• 第一章 体外实验部分SGK1在缺血大鼠海马神经元保护中的作用机制17-69
• 第一节 前言17-19
• 第二节 实验材料与方法19-43
• 一. 实验材料19-43
• (一) 主要仪器19-20
• (二) 主要试剂及其配方20-25
• (三) 实验方法25-42
• (四）统什学分析42-43
• 第三节 结果43-57
• 一. SD大鼠海马神经元细胞的培养及鉴定结果43-45
• 二. 氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡及SGK1表达情况45-47
• 三. SGK1基因蛋白水平的过表达对氧糖剥夺的SD大鼠海马神经元的凋亡的影响47-53
• 四. SGK1通过PI3K/Akt/GSK3β通路介导细胞的抗凋亡作用53-57
• 第四节 讨论57-60
• 第五节 本章小结60-61
• 第六节 参考文献61-69
• 第二章 体内实验部分SGK1在大鼠脑缺血-再灌注损伤中的细胞保护作用69-98
• 第一节 前言69-72
• 第二节 实验材料与方法72-82
• 一. 实验材料72-82
• (一) 主要仪器72
• (二) 主要试剂及其配方72-76
• (三) 主要实验方法76-81
• (四) 统计学分析81-82
• 第三节 结果82-88
• 一. 大鼠脑缺血-再灌注模型制备及动物的分组82
• 二. 脑缺血-再灌注对细胞凋亡和SGK1表达水平的影响82-84
• 三. 脑缺血-再灌注时SGK1及PI3K信号途径对细胞保护的影响84-88
• 第四节 讨论88-92
• 第五节 本章小结92-93
• 第六节 参考文献93-98
• 第三章 小结与展望98-99
• 综述99-110
• 参考文献104-110
• 攻读博士学位期间发表的论文及所获奖励110-125
• 致谢125-126

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：671394