中枢神经系统损伤后谷氨酸的神经细胞毒性作用的机理研究

发布时间：2017-08-15 00:20

  本文关键词：中枢神经系统损伤后谷氨酸的神经细胞毒性作用的机理研究

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【摘要】：背景：L-谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经传导递质,主要位于大脑皮层和海马等部位。当谷氨酸病理性升高时,其作为一种神经毒素可以诱导严重的神经元损伤,谷氨酸介导的神经细胞的过度激活或谷氨酸的过度刺激都将引起细胞的死亡,这种病理过程被称为谷氨酸的神经毒性。因而谷氨酸被认为是“双刃剑”,既是神经递质又可以作为神经毒素。而此病理过程广泛的几乎存在于所有神经系统疾病中,包括脑出血(动脉瘤,高血压脑出血等),脑缺血,卒中,脑外伤,脑肿瘤以及一些神经退行性变疾病例如肌萎缩侧索硬化症,帕金森病慢性进行性舞蹈病等。近年来的研究发现谷氨酸的神经毒性伴随着线粒体膜电位的下降以及细胞内活性氧的过度生成,这些线粒体功能障碍指标提示谷氨酸的神经毒性与线粒体功能可能存在联系。线粒体是一种高度动态的细胞器,通过不断的分裂融合保持线粒体动力学稳态。最近研究发现当这种稳态被破坏时会影响到线粒体正常的功能,趋向于分裂导致线粒体碎片产生,线粒体缩短；相反趋向于融合时导致线粒体变长。线粒体的融合／分裂运动主要被一系列线粒体融合／分裂蛋白调控。这些蛋白主要包括了：分裂蛋白：.dynamin-like protein 1(DLP1,也叫Drp1),以及它的作用因子包括Fis1,Mff, MiD49 and MiD51;融合蛋白：Mitofusin 1 (Mfn1), Mitofusin 2 (Mfn2)以及optic atrophy protein 1(OPA1)。这些蛋白除了调控线粒体的形态,也在线粒体功能正常运行的各个环节上有重要的作用。因而顺理成章,目前已有很多研究表明线粒体的分裂／融合稳态的改变可以导致线粒体的功能障碍,引起相关神经疾病。既然谷氨酸介导的神经毒性与线粒体功能相关,而线粒体功能又与线粒体动力学稳态相关,那么线粒体的动力学稳态是否就是谷氨酸介导的神经毒性的关键一环呢?为了解决这个问题,我们分别在大鼠原代神经细胞,小鼠谷氨酸模型,转基因小鼠以及人体上,从体外实验到体内实验应用转染,RNAi抑制,基因敲出,基因过表达,免疫印迹杂交,PCR,免疫组化,免疫荧光共聚焦,电镜,LDH,ROS, MMP, OCR, ATP测定等实验技术进行了全方位立体化的探索。目的：通过对大鼠原代神经细胞,谷氨酸灌注小鼠模型,转基因小鼠,人体标本的研究,探索谷氨酸的神经毒性信号通路,然后找到并证实介导谷氨酸神经毒性的关键蛋白,最终在细胞内,细胞外,动物模型以及人体上阐明并证明谷氨酸的神经毒性机理以及信号通路。方法和材料：抗体、质粒、化学试剂及测量方法购买或获得质粒：MitoDsRed2 (Clontech 公司, Mountain View, CA), Case 12 construct(来自Evrogen公司,Moscow, Russia), GFP-Cre (来自Addgene公司,Cambridge MA)以及GFP/Myc-tagged Mfn2(斯坦福大学提供).通过neomycin/kanamycin抑制基因在MitoDsRed2序列中利用核定位信号(GFP-Cre质粒中的NLS-Cre)增加Cre序列成功构建MitoDsRed2/Cre双启动子质粒.克隆mitoDsRed2并导入pLVX-Puro (Clontech公司,Mountain View, CA)质粒用NLS-Cre替代puromycin抑制基因成功构建MitoDsRed2/Cre双启动子慢病毒。利用第三代慢病毒包装盒(包装系统：pMDLg/pRRE和pRSV-Rev;包裹质粒：Addgene公司,Cambridge MA 的pMD2.G)成功制备慢病毒。以下抗体应用于本实验包括mouse anti-VDAC1/rabbit anti-Mff/Spectrin抗体(来自Abcam公司,Cambridge, MA), rabbit anti-Calpainl,Calpain 2 and cleaved caspase-3抗体(来自Cell signaling公司,Danvers,MA),rabbit anti-Mfn1/mouse anti-Mfn2抗体(来自Santa Cruz, Dallas公司,Texas),mouse anti-HB9抗体(来自D SHB公司,Iowa City, IA),mouse anti-GFAP抗体(来自Invitrogen公司,Grand Island, NY), rabbit anti-Ibal抗体(来自Wako,Richmond, VA) mouse anti-DLP1/OPA1/Tom20抗体(来自BD公司,Franklin Lakes, NJ)以及mouse anti-actin/rabbit anti-MAP2抗体(来自Millipore公司,Billerica, MA).谷氨酸(来自Sigma公司,St. Louis, MO) and MK-801/Calpeptin/BAPTA-AM/Z-VAD-FMK制剂(来自Tocris公司,Minneapolis, MN).利用ATP Colorimetric/Fluorometric试剂盒(来自Biovision公司,Milpitas,CA)测定ATP水平。运动神经细胞以60,000个细胞/孔的密度培养,其氧消耗量的测定由Seahorse XF24 Analyzer (Seahorse Bioscience公司,North Billerica,MA)完成.在不同的时间点分别注射ATP合成抑制剂oligomycin(1μM),解偶联剂FCCP(4μM)and复合物Ⅰ抑制剂antimycin A (1μM)和rotenone (1μM)。得到数据后,裂解细胞并测定细胞总蛋白,氧消耗量根据总蛋白不同进行标准化量化。通过Cytotoxicity Detection试剂盒(LDH; Roche公司,Nutley, NJ)或Cell Proliferation试剂盒(MTT法；Roche公司,Nutley, NJ)测定细胞死亡和生存率。通过细胞普罗匹定碘化物测定神经细胞存活率。 带有普罗匹定碘化物阳性细胞核或者可见的细胞核碎片或神经突碎片的神经细胞计作坏死神经细胞,而普罗匹定碘化物阴性的细胞核并且具有完整的神经细胞核轮廓或者神经突的神经元计为存货细胞。原代神经细胞的分离原代神经细胞分离(应用大鼠脑组织或胚胎或)利用鼠Thy-1.2基因表达盒将Thyl-Mfn2注射入C57BL/6N鼠受精卵内成功构建mfn2过表达小鼠。根据美国动物保健和使用委员会(IACUC)制定的指南处理适宜怀孕时间的Sprague-Dawley母鼠(大鼠)(Harlan or Charles River)或者C57BL/6N母鼠(小鼠),成功从E13-15母鼠(大鼠)/E12-14母鼠(小鼠)胚胎中分离原代运动神经细胞,从E18母鼠(大鼠)胚胎中分离原代神经细胞。线粒体的纯化及蛋白质印记分析在细胞中加入1xLysis buffer(Cell Signaling公司, Danvers,MA)和 1 mM PMSF(Sigma公司,St. Louis, M O)以及蛋白酶抑制剂(Sigma公司,St. Louis, MO)提取总蛋白.用SDS-PAGE溶解同样体积的总蛋白然后转到Immobilon-P (Millipore公司,Billerica, MA)膜.10%的脱脂牛奶封闭后,用一抗二抗进行孵育,蛋白膜用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore公司,Billerica, MA)显影剂进行显影曝光.谷氨酸灌注小鼠动物模型的建立所有小鼠的手术及手术过程严格按照美国NIH指南进行,并且依据动物护理及使用协会IACUC的规定进行操作。迷你渗透性泵(2001模型,Alzet公司,C upertino,CA；液体泵速率1μl/小时)接入2cm的大脑注入管(脑注入盒,Alzet公司,Cupertino, CA)并在其中分别泵入模拟脑脊液aCSF(成分：124 mM NaCl,25 mM NaHCO3,10 mM D-glucose,2.5 mM KCl,1 mM MgC12,2 mM CaC12和1 mM NaH2PO4,并用NaOH调节pH到7.2-7.4)或者aCSF溶解10 mM谷氨酸。并依据使用说明在37度环境下通宵注射药物。小鼠中枢神经系统的免疫组织化学和免疫荧光检测成功构建免疫荧光小鼠,以便于利用线粒体特征蛋白Tom20和VDA C1更好的观察运动神经细胞内线粒体的形态。简要介绍过程如下：用蒸馏水冲洗3次组织切片放置于1x抗原decloaker(Biocare公司,Concord, CA)试剂中。在22psi气压下加热至125度10秒,然后在0 psi气压下冷却至90度30秒,利用Biocare公司的高压锅进行抗原修复。随后用10%的羊血清Decloaking Chamber对切片封闭30分钟,并在1%羊血清的PBS中孵育一抗过夜。第二天(NGS, St. Louis, MO)PBS冲洗3次后用10%的羊血清孵育10分钟,然后加入荧光显影二抗公司,(Invitrogen室温避光孵育2小时,最后切片用PBS清洗,用Grand Island, NY)(1:300)染色,再次用PBS洗3次,加入荧光介质油DAPI公司,(Southern Biotech小鼠中枢神经系统的电镜检测Birmingham, AL)。EM固定液通过心脏灌注法(the quarter strength Karnovsky-1.25% DMSO mixture)输入小鼠体内5分钟后迅速取出脊髓并放置于EM固定液中室温15分钟,更换新鲜EM固定液继续固定2小时。PBS清洗后组织块用室温固定2小时。组织切片清洗后浸泡在酸化的0.5%1% osmium-1.25% ferrocyanide mixture溶液中.再次冲洗后组织块在浓度依次上升的酒精中脱水,最后包uranylacetate裹在树脂中Poly/Bed 812公司,(Polysciences较薄的切片随后Warrington, PA).用2%酸化染色并用uranyl acetate电镜观Gatan single tilt,Gatan US4000 4kx4k CCD察公(Gatan司,体外钙蛋白酶切割实验Pleasanton, CA)。100ug纯化线粒体蛋白以及lug重组Mfn2蛋白公司,(Origen e分别与人红细胞纯化Rockville, MD)公司,u-calpain(calpain-1) (Biovision蛋白在Milpitas, CA)30度孵育30分钟。以提前与calpain-Ⅰ或者PMSF度孵育5分钟为抑calpeptin30制组。最后添加含有62.5T和nM Tris-HCl,4% SDS,10% glycerol,50 mM DT.8)的SDS样本液停止反应.样本经过100度10分钟0.1% bromophenol blue (pH 6变性煮沸,加入1/6的反应蛋白量进行免疫印迹分析。结果：1.在神经细胞中谷氨酸可导致线粒体破裂2.在神经细胞中,Mfn2的缺失可导致线粒体和神经细胞的毒性3.细胞实验：Mfn2过表达可以阻断谷氨酸介导的线粒体功能障碍和神经细胞死亡4.动物实验：Mfn2过表达可以保护线粒体和神经细胞免于谷氨酸所引起的细胞毒性5.谷氨酸作用于神经细胞后通过激活Calpain来实现对mfn2的剪切6.在人体标本中验证了谷氨酸所介导的calpain的激活,mfn2的剪切,以及线粒体的破裂结论：谷氨酸介导calpain的激活剪切mfn2后,可引起线粒体功能障碍及运动障碍,最终出现谷氨酸的神经毒性并导致神经细胞的死亡。通过阻断mfn2的剪切可以在细胞模型及动物模型上阻断谷氨酸所介导的神经毒性。创新性及意义：谷氨酸的神经毒性作用广泛存在神经系统疾病中包括脑出血,卒中,脑肿瘤,中枢系统感染,并且与相关疾病的发生有密切的关系。本实验从体内到体外,从细胞模型到动物模型再到人体模型均证实了谷氨酸所介导的mfn2剪切所导致的神经毒性,意义重大,相关信号通路将可能成为未来几年的研究热
【关键词】：谷氨酸 线粒体功能障碍 神经毒性 mfn2蛋白 Calpain蛋白
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要8-13
• 英文摘要13-19
• 符号说明19-21
• 前言及综述21-25
• 第一部分 谷氨酸神经毒性对线粒体的影响25-33
• 引言25
• 材料及方法25-27
• 结果27-31
• 讨论和小结31-32
• 结果小结32
• 结论小结32-33
• 第二部分 谷氨酸诱导神经毒性与线粒体动力学蛋白的关系33-51
• 引言33
• 材料及方法33-40
• 结果40-49
• 讨论和小结49-50
• 结果小结50
• 结论小结50-51
• 第三部分 调节线粒体动力学蛋白能否抑制谷氨酸所介导的神经毒性?51-80
• 引言51
• 材料及方法51-58
• 结果58-77
• 讨论和小结77-79
• 结果小结79
• 结论小结79-80
• 第四部分 谷氨酸介导神经毒性的信号通路80-100
• 引言80
• 实验方法80-84
• 结果84-96
• 讨论和小结96-97
• 结果小结97-98
• 结论小结98-100
• 第五部分 在人体标本中验证谷氨酸介导神经毒性在相关疾病中的信号通路100-112
• 引言100
• 材料与方法100
• 结果100-110
• 讨论及小结110-111
• 结果小结111
• 结论小结111-112
• 讨论总结112-115
• 参考文献115-123
• 致谢123-124
• 攻读学位期间发表的论文目录124-125
• 英文文章一125-160
• 英文文章二160-181
• 附表181

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 韩玉霞;魏欣冰;李霞;丁燕;辛华;丁华;;绞股蓝总皂苷对谷氨酸所致大鼠海马组织损伤的保护作用[J];山东大学学报(医学版);2008年05期

2 孙蓉;张作平;黄伟;吕丽莉;尹建伟;;麝香酮对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护及作用机制研究[J];中国中药杂志;2009年13期

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本文编号：675437