非小细胞肺癌中PD-L1的表达调控及其机制研究

发布时间：2017-08-19 06:04

  本文关键词：非小细胞肺癌中PD-L1的表达调控及其机制研究

  更多相关文章： 非小细胞肺癌 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 PD-L1 NF-κB

【摘要】：研究背景及目的肺癌是世界上发病率最高的实体瘤之一,而其中非小细胞肺癌(NSCLC)又占据了大部分比例。虽然针对NSCLC的治疗方法如传统手术、基于铂类药物的化疗以及放疗等都有迅速的发展,但是进展期及发生转移的NSCLC患者仍旧预后不良。因此,着力探索更新更有效的临床治疗策略是一个亟待解决的问题。现今,靶向表皮生长因子受体(EGFR)的治疗药酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼和厄洛替尼已经成为了治疗存在EGFR突变NSCLC患者的一线药物。同时,靶向免疫“检查点”如PD-1、PD-L1和CTLA-4的治疗药也已经被报道能显著延长肿瘤患者的中位无进展生存期。但是,如何设计更合理的治疗策略以及如何联合以上两种新治疗措施以达到更好疗效仍旧所知甚少。最近有研究发现,具有EGFR突变的NSCLC细胞株会比具有其它突变类型的细胞株表达更高水平的PD-L1,但是其潜在的调节机制未有报道。本课题着力于寻找不同NSCLC细胞株EGFR突变状态和PD-L1表达的相关性并考察EGFR-TKIs对EGFR-TKI敏感型以及获得性耐药型两种NSCLC细胞株在体内及体外模型中的影响,同时探讨该作用的相关机制。因此,该项工作能够为临床抗肿瘤免疫治疗的完善提供新的策略。研究方法1.NSCLC细胞株EGFR突变状态和PD-L1表达的相关性分析提取NSCLC细胞株的总DNA并用PNA-LNA PCR检测EGFR突变状态。流式细胞分析检测NSCLC细胞株的PD-L1表达水平。在NSCLC细胞株的培养环境中加入人源性重组EGF并用流式细胞分析和实时定量PCR检测其PD-L1的表达。2.EGFR-TKIs对EGFR-TKI敏感型和获得性耐药型NSCLC细胞株PD-L1表达的影响体外实验部分,在NSCLC细胞株培养环境中加入不同剂量梯度(0、2.5、5、10、100nM)的吉非替尼刺激一定时间(48小时)或者加入同一剂量(100n M)吉非替尼刺激不同时间(0、6、12、24、48小时),通过流式细胞分析和免疫荧光检测其PD-L1的表达。体内实验部分,裸鼠皮下注射nsclc细胞株,待肿瘤长至一定大小给予吉非替尼灌胃治疗,之后测量肿瘤的体积和重量以及用流式细胞分析和免疫荧光检测肿瘤组织中pd-l1的表达水平。3.nsclc细胞株中egfr介导的pd-l1表达上调过程的机制研究体外实验部分,用westernblotting检测不同nsclc细胞株中nf-κbp65在胞浆和胞核的表达水平。用不同剂量(0、50、100μm)的nf-κb抑制剂pdtc刺激nsclc细胞株一段时间并用流式细胞分析检测其pd-l1表达。在nsclc细胞株培养环境中用不同剂量(0、2.5、5、10、100nm)吉非替尼刺激一段时间,用westernblotting分别检测其胞浆和胞核nf-κbp65的表达水平。体内实验部分,在上述的吉非替尼治疗的裸鼠荷瘤模型中,用免疫荧光检测各组裸鼠肿瘤组织中nf-κbp65的表达水平。研究结果1.nsclc细胞株中egfr活化水平和pd-l1表达相关pna-lnapcr发现nsclc细胞株pc-9、hcc827和h1650具有egfr基因第19号外显子的突变而h460、h1299和spc-1a的egfr基因无突变。流式细胞分析显示egfr突变型细胞株的pd-l1比egfr野生型细胞株的pd-l1表达更高。流式细胞分析和定量pcr显示外源性rhegf刺激egfr野生型细胞株后能有效上调其pd-l1的表达。2.吉非替尼能够可逆性降低egfr突变型nsclc细胞株pd-l1的表达,且该作用具有浓度和时间依赖性流式细胞分析和免疫荧光显示不同浓度的吉非替尼刺激pc-9和hcc827一段时间或者一定浓度吉非替尼刺激pc-9和hcc827不同持续时间都能降低其pd-l1的表达水平,且降低程度与药物作用的浓度及时间呈正相关。同时,流式细胞分析发现撤去吉非替尼的刺激或者同时加入外源性rhegf能够恢复吉非替尼预处理的pc-9细胞株pd-l1的表达水平。3.吉非替尼能够降低egfr-tki获得性耐药nsclc细胞株的pd-l1表达,并且该作用具有浓度和时间依赖性流式细胞分析显示吉非替尼也能够有效降低吉非替尼获得性耐药pc-9细胞株pd-l1的表达,并且pd-l1降低程度与吉非替尼作用的浓度和持续时间呈正相关。4.在pc-9细胞株异种种植裸鼠模型中,吉非替尼的治疗能够抑制肿瘤的生长并且降低肿瘤组织pd-l1的表达水平吉非替尼治疗能够有效减少裸鼠pc-9皮下种植瘤的体积和重量。同时,流式细胞分析和免疫荧光显示吉非替尼治疗组裸鼠肿瘤组织中PD-L1的表达水平比对照组肿瘤组织的表达水平明显升高。5.NF-κB通路参与EGFR-TKI对PD-L1的调控过程Western Blotting结果显示,相较于EGFR突变型NSCLC细胞株,在EGFR野生型细胞株中NF-κB p65在胞浆的表达水平更高而在胞核的表达水平更低。流式细胞分析发现NF-κB抑制剂PDTC处理PC-9细胞株其PD-L1的表达水平明显升高且升高程度依赖于PDTC的剂量。Western Blotting显示不同浓度的吉非替尼刺激PC-9细胞株嫩能够升高NF-κB p65胞浆表达并降低NF-κB p65胞核表达且改作用具有浓度依赖性,但吉非替尼对H1299细胞株NF-κB p65的表达无影响。PC-9细胞株裸鼠异种种植模型中,免疫荧光显示吉非替尼灌胃治疗也能够降低肿瘤组织中NF-κB p65的核表达。研究结论1.PD-L1在EGFR突变型NSCLC细胞株中高表达并且其在EGFR野生型细胞株中的表达受EGFR信号调控。2.EGFR-TKI能够有效降低EGFR-TKI敏感型以及EGFR-TKI获得性耐药型NSCLC细胞株中PD-L1的表达水平,并且该作用具有药物浓度及时间依赖性。3.EGFR-TKI治疗能抑制肿瘤生长并降低肿瘤组织中PD-L1的表达。4.EGFR信号对PD-L1表达的作用是通过NF-κB通路实现的。
【关键词】：非小细胞肺癌 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 PD-L1 NF-κB
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 PD-L1在非小细胞肺癌细胞株的表达与EGFR突变状态的相关性研究16-29
• 2.1 材料与方法16-23
• 2.2 结果23-27
• 2.3 讨论27-29
• 第三章 EGFR-TKI对EGFR突变药物敏感型人非小细胞肺癌细胞株PD-L1表达水平的作用研究29-43
• 3.1 材料与方法29-34
• 3.2 结果34-41
• 3.3 讨论41-43
• 第四章 EGFR-TKI对EGFR突变耐药型人非小细胞肺癌细胞株PD-L1表达水平的作用研究43-51
• 4.1 材料与方法43-46
• 4.2 结果46-49
• 4.3 讨论49-51
• 第五章 EGFR-TKI对EGFR突变型人非小细胞肺癌细胞株体内成瘤的治疗作用研究51-61
• 5.1 材料与方法51-55
• 5.2 结果55-59
• 5.3 讨论59-61
• 第六章 EGFR信号对人非小细胞肺癌细胞株PD-L1表达调控的机制研究61-76
• 6.1 材料与方法61-68
• 6.2 结果68-73
• 6.3 讨论73-76
• 全文结论76-77
• 参考文献77-85
• 文献综述一 非小细胞肺癌中PD-1/PD-L1通路的作用及其与EGFR突变的关系研究进展85-96
• 参考文献90-96
• 文献综述二EGFR-TKI用于肺癌治疗的研究进展96-114
• 参考文献102-114
• 博士研究生期间发表文章和待发文章114-115
• 致谢115-116

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 赵晓红,王勋陵,牛静萍,王静;兰州市交通要道颗粒物污染状况及其致突变活性的研究[J];环境科学学报;2001年04期

2 张雪梅,张雪怡,张志,杨文敏;大气颗粒有机提取物的染色体损伤作用研究[J];环境与健康杂志;2002年03期

3 徐春雨;徐东群;常君瑞;王秦;汪静;董小艳;李韵谱;王桂芳;;环境空气污染对交通警察血清氧化应激指标的影响[J];环境与健康杂志;2009年09期

4 李朋昆;高知义;蒋蓉芳;盖冰冰;秦逸秋;宋伟民;;细颗粒物暴露对人群DNA损伤的影响[J];环境与职业医学;2010年05期

5 丁国武,王文军,王晓云;兰州市不同地区大气悬浮颗粒物的遗传毒性研究[J];兰州医学院学报;1999年01期

6 朱惠刚;赵启宇;蒋颂辉;;大气颗粒物致突变性研究[J];上海环境科学;1991年06期

7 彭宝成，叶舜华;越江隧道线公交车司机和售票员细胞遗传学效应调查[J];中国工业医学杂志;1995年06期

8 姚加钦;赵贤四;朱惠刚;;小鼠微核试验检测大气颗粒物致突变性[J];上海环境科学;1993年03期

，

本文编号：699045