IL-37b基因修饰的骨髓间充质干细胞对DSS诱导的肠炎缓解作用的研究

发布时间：2017-08-19 13:20

  本文关键词：IL-37b基因修饰的骨髓间充质干细胞对DSS诱导的肠炎缓解作用的研究

  更多相关文章： 白介素37b 肠炎 间充质干细胞 调节性T细胞 髓系来源抑制性细胞 人白介素37b 乳腺癌 抗肿瘤作用 CD4+T细胞 肿瘤微环境

【摘要】：目的白介素37b(IL-37b)具有显著的免疫抑制功能,骨髓间充质干细胞(MSC)对炎症性肠病具有缓解作用并且是理想的外源基因表达载体。本研究的目标是观察IL-37b基因修饰的小鼠MSC对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的炎症性肠病小鼠模型的缓解效果并探讨发挥作用的机制。方法实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫组化检测溃疡性结肠炎病人的病变肠组织中IL-37基因的m RNA和蛋白表达情况。构建表达IL-37b基因的腺病毒载体。C57BL/6小鼠致密骨片中分离培养MSC,流式细胞仪鉴定MSC表面标记分子,油红O和von Kossa染色鉴定MSC成脂成骨分化潜能。携带IL-37b基因的腺病毒转染MSC后RT-PCR、western blot和ELISA鉴定IL-37b在MSC中的表达。C57BL/6小鼠饮用3%DSS连续8天,制备炎症性肠病小鼠模型。在给于3%DSS的第一天,将小鼠随机分为MSC-IL37b组(腹腔注射转染IL-37b基因的MSC),MSC-e GFP组(腹腔注射转染对照病毒的MSC),MSC组(腹腔注射未转染病毒的MSC)和PBS组(腹腔注射PBS)。每日记录小鼠体重和大便情况,第10天处死小鼠,取结肠,测量结肠长度,HE评估结肠炎症严重程度;取小鼠脾脏,流式细胞仪分析脾脏单个核细胞中髓系来源抑制性细胞(MDSCs,CD11b+Gr1+)和CD4+T细胞中调节性T细胞(Tregs,CD4+CD25+Foxp3+)比例,细胞内因子染色(ICS)分析CD4+和CD8+T细胞炎症因子表达情况。结果IL-37基因在溃疡性结肠炎病人的病变组织中表达明显增高,且其蛋白表达水平随炎症程度的增加而增加,提示其参与了整个疾病进展过程。培养至P3时超过95%细胞表达典型的MSC表面标记分子,且能成功分化为成脂和成骨细胞。IL-37b基因修饰的MSC分泌性表达IL-37b蛋白(13.03±1.023 ng/ml)。第10天处死小鼠,结果显示:MSC-IL37b组的体重减少程度显著低于PBS组(85.74±2.01%vs.73.85±2.18%,P0.05),PBS组与MSC组或MSC-e GFP组相比,体重减少趋势更明显,但无统计学差异(73.85±2.18%vs.80.36±2.28%P=0.07;73.85±2.18%vs.77.38±2.21%,P=0.28);MSC-IL37b组(5.733±0.1706 cm)的平均结肠长度显著高于PBS组(4.375±0.2287 cm,P0.001)、MSC组(5.117±0.1078 cm,P0.05)和MSC-e GFP组(4.967±0.1333 cm,P0.01),MSC组或MSC-e GFP组的结肠长度都显著高于PBS组(P0.01,P0.05);病变肠组织的炎症评分MSC-IL37b组(2.9±0.2449)显著低于PBS组(5±0.4,P0.01)、MSC组(3.9±0.3317,P0.05)和MSC-e GFP组(4.2±0.3742,P0.05),MSC组显著低于PBS组(P0.05),MSC-e GFP组有低于PBS组的趋势,但无统计学差异(P=0.0639);在第10天实验结束时,MSC-IL37b组、MSC组和MSC-e GFP组无小鼠死亡,而PBS组的死亡率可达到66.7%,显著高于其它各组;脾脏CD4+T细胞中Tregs的比例MSC-IL37b组(18.95±0.9919%)显著高于MSC-e GFP组,(12.53±0.6977%,P0.001)、MSC组(13.89±0.7742%,P0.01)和PBS组(10.10±0.8365%,P0.0001),MSC组显著高于PBS组(P0.05),但MSC-e GFP组和PBS组之间的差异无统计学意义;脾脏单个核细胞中MDSCs的比例MSC-IL37b组(4.843±0.1648%)显著高于PBS组(2.693±0.4248%,P0.01)和MSC-e GFP(3.103±0.2551%,P0.05),但与MSC组(3.643±0.3143%,P=0.112)之间的差异无统计学意义;细胞内因子染色结果显示具有诱导Tregs分化功能的抑炎因子IL-2在CD4+T细胞中的表达水平明显上调,而促炎因子IFN-γ在CD4+和CD8+T细胞中的表达水平明显上调。结论IL-37b可能作为重要的抑炎因子参与了溃疡性结肠炎的疾病进展过程。IL-37b基因修饰的MSC能明显缓解DSS诱导的肠炎小鼠模型的炎症严重程度,其缓解作用优于未进行基因修饰的MSC,其机制可能是通过促进Treg和MDSC细胞分化以及下调IFN-γ的表达实现的。目的:除免疫抑制功能外,有文献报道IL-37b具有抗癌作用,但其潜在机制还不十分明确。在本研究中,我们探索了IL-37b基因转染对4T1乳腺癌生长的影响以及其机制。方法:将IL-37b腺病毒表达载体Ad-IL37b转染小鼠乳腺癌细胞系4T1(转染IL-37b基因的细胞命名为4T1-IL37b)。通过ELISA检测4T1-IL37b是否分泌性表达IL-37b蛋白。通过体外细胞增殖实验明确IL-37b基因表达是否影响4T1细胞生长。将4T1-IL37b细胞或将未转染IL-37b基因的4T1细胞与丝裂霉素处理的4T1-IL37b细胞(生长停滞,不具备成瘤性)注射至BALB/c小鼠皮下,评估肿瘤生长速度和小鼠存活率。通过CFSE实验检测IL-37b重组蛋白对T细胞体外增殖的影响。将4T1-IL37b细胞注射至BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠,评估肿瘤的生长速度和小鼠的存活率。结果:病毒转染48小时后,4T1-IL37b上清中能检测到12.2±0.684 ng/ml的IL-37b蛋白。IL-37b基因的表达不影响4T1细胞的增殖速度。与不表达IL-37b基因的4T1或4T1-相比,4T1-IL37b在正常BALB/c小鼠体内的肿瘤生长速度明显更缓慢。未转染IL-37b基因的4T1细胞与丝裂霉素处理的4T1-IL37b细胞共注射组肿瘤的生长速度也明显减缓。IL-37b重组蛋白对CD4+T细胞显示直接激活作用,但对CD8+T细胞未显示激活作用。IL-37b基因转染在BALB/c裸鼠和NOD-SCID小鼠体内未显示抗肿瘤作用。结论:IL-37b基因通过作用于肿瘤微环境进而影响T细胞活化起到抗4T1乳腺癌的作用。
【关键词】：白介素37b 肠炎 间充质干细胞 调节性T细胞 髓系来源抑制性细胞 人白介素37b 乳腺癌 抗肿瘤作用 CD4+T细胞 肿瘤微环境
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62
【目录】：

• PARTⅠ IL-37b基因修饰的骨髓间充质干细胞对DSS诱导的肠炎缓解作用的研究4-73
• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略语/符号说明8-15
• 前言15-23
• 研究现状、成果15-20
• 研究目的、方法20-23
• 一、IL-37在人溃疡性结肠炎(UC)病变组织中的表达23-29
• 1.1 对象和方法23-26
• 1.1.1 人UC标本的收集23
• 1.1.2 UC病理组织学分级标准23
• 1.1.3 活检组织总RNA提取23-24
• 1.1.4 样本c DNA的制备24
• 1.1.5 Real-time PCR24-25
• 1.1.6 免疫组化（SABC法）25-26
• 1.2 结果26-28
• 1.2.1 IL-37 m RNA表达水平在人活动性溃疡性结肠炎组织中的表达水平显著高于正常组织26-27
• 1.2.2 IL-37b蛋白表达水平与人活动性溃疡性结肠炎的病理分级呈正相关27-28
• 1.3 讨论28
• 1.4 小结28-29
• 二、IL-37b腺病毒表达载体（Ad-IL37b）的构建29-35
• 2.1 对象和方法29-32
• 2.1.1 IL-37b腺病毒包装质粒的构建29-30
• 2.1.2 腺病毒的包装30
• 2.1.3 腺病毒的大量扩增和收集30-31
• 2.1.4 病毒滴度检测31-32
• 2.2 结果32-34
• 2.2.1 IL-37b基因的c DNA序列成功连接入腺病毒包装质粒32-33
• 2.2.2 腺病毒包装和扩增过程中出现的细胞病变斑33
• 2.2.3 腺病的滴度测定结果33-34
• 2.3 讨论34
• 2.4 小结34-35
• 三、小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离培养和鉴定35-43
• 3.1 对象和方法35-38
• 3.1.1 小鼠骨髓MSCs的分离35-36
• 3.1.2 小鼠骨髓MSCs的传代培养与扩增36
• 3.1.3 小鼠骨髓MSCs的冻存36
• 3.1.4 小鼠骨髓MSCs的复苏36-37
• 3.1.5 小鼠骨髓MSCs的免疫表型鉴定37
• 3.1.6 小鼠骨髓MSCs的多系分化潜能鉴定37-38
• 3.2 结果38-41
• 3.2.1 小鼠骨髓MSCs的贴壁培养38-39
• 3.2.2 小鼠骨髓MSCs的免疫表型39-40
• 3.2.3 小鼠骨髓MSCs的成脂、成骨分化40-41
• 3.3 讨论41-42
• 3.4 小结42-43
• 四、Ad-IL37b转染MSCs以及IL-37b基因在MSCs中的表达43-50
• 4.1 对象和方法43-48
• 4.1.1 腺病毒转染43
• 4.1.2 细胞总RNA的提取及IL-37b m RNA表达水平的检测43
• 4.1.3 细胞总蛋白的提取和定量43-44
• 4.1.4 Western blot检测IL-37b的蛋白表达水平44-47
• 4.1.5 流式细胞仪检测病毒转染效率47
• 4.1.6 ELISA检测细胞培养上清中IL-37b蛋白浓度47-48
• 4.1.7 本部分研究的流程图48
• 4.2 结果48-49
• 4.2.1 腺病毒Ad-IL37b感染MSCs的效率48-49
• 4.2.2 IL-37b在MSC-IL37b中的表达49
• 4.3 讨论49
• 4.4 小结49-50
• 五、MSC-IL37b对DSS诱导的实验性肠炎的缓解作用50-64
• 5.1 对象和方法50-53
• 5.1.1 小鼠DSS肠炎模型的构建50
• 5.1.2 DSS小鼠肠炎模型干预效果评估50
• 5.1.3 小鼠肠炎病理组织学评分标准50-51
• 5.1.4 小鼠脾脏单个核细胞的提取51
• 5.1.5 小鼠脾脏调节性T细胞的流式细胞仪分析51
• 5.1.6 小鼠脾脏髓系来源的抑制性细胞的流式细胞仪分析51-52
• 5.1.7 小鼠脾脏来源的CD4+和CD8+细胞内因子染色的流式细胞仪检测52
• 5.1.8 统计学处理方法52-53
• 5.2 结果53-59
• 5.2.1 不同干预肠炎小鼠的体重变化情况53
• 5.2.2 不同干预肠炎小鼠的生存率比较53-54
• 5.2.3 不同干预肠炎小鼠的结肠长度比较54-55
• 5.2.4 不同干预肠炎小鼠的结肠炎症组织学评分55-56
• 5.2.5 不同干预肠炎小鼠脾脏CD4+ T细胞中Treg所占比例的比较56-57
• 5.2.6 不同干预肠炎小鼠脾脏髓系来源的抑制性细胞含量的比较57-58
• 5.2.7 不同干预肠炎小鼠脾脏T中细胞内因子表达情况比较58-59
• 5.3 讨论59-63
• 5.4 小结63-64
• PARTⅠ全文结论64-65
• PARTⅠ论文创新点65-66
• PARTⅠ参考文献66-73
• PART Ⅱ IL-37b基因转染对 4T1小鼠乳腺癌生长速度影响的研究73-91
• 中文摘要73-74
• Abstract74-75
• 前言75-76
• 研究现状、成果75
• 研究目的、方法75-76
• 1.对象和方法76-80
• 1.1 实验动物及实验细胞76
• 1.2 4T1小鼠乳腺癌细胞的培养76
• 1.3 4T1细胞系的冻存与复苏76
• 1.4 小鼠淋巴结T细胞的分离76-77
• 1.5 免疫磁珠分选法分离CD4+ T细胞和CD8+ T细胞77-78
• 1.6 IL-37b重组蛋白对T细胞体外活化和增殖的影响78-79
• 1.7 Ad-IL37b重组腺病毒转染 4T1小鼠乳腺癌细胞79
• 1.8 IL-37b基因在 4T1-IL37b细胞内表达的检测79
• 1.9 IL-37b基因转染对 4T1增殖能力的影响79
• 1.10 丝裂霉素C处理 4T1-IL37b或 4T1-e GFP细胞79
• 1.11 小鼠成瘤实验79-80
• 1.12 统计学处理方法80
• 2.结果80-84
• 2.1 IL-37b基因在 4T1-IL37b细胞中的表达及对癌细胞增殖的影响80-81
• 2.2 4T1、4T1-e GFP 和 4T1-IL37b 在 BALB/c 小鼠体内肿瘤生长速度的比较81-82
• 2.3 丝裂霉素C处理的 4T1-IL37b细胞对 4T1肿瘤生长的影响82-83
• 2.4 重组IL-37b蛋白对T细胞体外增殖的影响83
• 2.5 4T1-IL37b在BALB/c裸鼠和NOD/SCID小鼠体内的肿瘤生长情况83-84
• 3.讨论84-87
• PARTⅡ全文结论87
• PARTⅡ论文创新点87-88
• PARTⅡ参考文献88-91
• 发表论文和参加科研情况说明91-93
• 附录93-98
• 一、主要仪器93-94
• 二、主要试剂94-96
• 三、主要溶液配制96-98
• 综述98-115
• 综述参考文献109-115
• 致谢115

【共引文献】

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