Micro-RNA21在高糖诱导巨噬细胞凋亡中作用的研究
发布时间：2017-08-25 00:41
本文关键词：Micro-RNA21在高糖诱导巨噬细胞凋亡中作用的研究
更多相关文章： microRNA-21 程序化细胞死亡分子4 巨噬细胞 凋亡 高浓度葡萄糖 动脉粥样硬化 匹伐他汀钙 高胆固醇血症 左心房 应变
【摘要】：背景微小RNA (MicroRNA, miRNA)最先是由Ruvkun G在线虫中发现的具有调节细胞发育时序功能的小分子RNA。多项研究已证明,miRNAs参与了细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成等多种生物学过程的基因表达与调控。研究发现microRNA-21(miR-21)在多种心血管疾病中的表达均增加,并参与了细胞增殖和分化等过程。研究发现在动脉粥样斑块中miR-21的表达上调,但miR-21参与粥样硬化的机制仍需进一步研究。巨噬细胞在易损斑块形成、发展及破裂中的作用已被广泛研究,巨噬细胞凋亡的机制目前尚在研究中,目前的研究发现多种信号传导通路参与了巨噬细胞的凋亡。研究发现miR-21可通过下调PDCD4的表达来促进细胞增殖。另外,miR-21的过表达可以抑制正常细胞凋亡信号传导,抑制miR-21可促进细胞凋亡。因此,由miR-21介导的细胞凋亡可能是粥样硬化形成的一个机制,同时miR-21可能参与了巨噬细胞凋亡的过程。糖尿病病人冠状动脉粥样硬化的发生率显著增加,同时糖尿病也是心血管疾病发生的重要危险因素。既往研究发现巨噬细胞凋亡在糖尿病病人冠状动脉易损斑块形成中起重要作用。MiR-21是否参与了高浓度葡萄糖状态下的巨噬细胞凋亡过程尚未见报道。目的研究miR-21在高浓度葡萄糖作用下巨噬细胞中的表达情况,并探讨miR-21在高浓度葡萄糖刺激下抑制巨噬细胞凋亡的作用机制。方法1.细胞培养及处理：应用含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养Raw264.7细胞50ml细胞培养瓶中,37℃细胞培养箱中孵育。细胞生长至近汇合状态时用细胞刮刀刮除细胞,重新种植于6孔或12孔板中。Raw264.7细胞生长至融合的70%-80%时,换1%血清的DMEM培养液,37℃继续孵育过夜,使细胞进入生长静止期,随后进行干预。应用不同浓度的葡萄糖(5.5mmol/L、 25mmol/L)及甘露醇(25mmol/L)分别处理Raw264.7细胞24小时。2.实时定量PCR方法：应用实时定量PCR (RT-PCR)方法检测Raw264.7细胞miR-21及PDCD4、 Caspase-3、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,磷酸酶基因)mRNA的表达情况。3.寡核苷酸转染：应用miR-21抑制剂转染Raw264.7细胞。4. Western Blot分析：检测PDCD4、 PTEN、 Caspase-3蛋白在细胞中的表达情况。5.流式细胞仪分析：应用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡情况。结果1.为研究高浓度葡萄糖对巨噬细胞中miR-21表达的调节作用,Raw264.7细胞在无血清的状态下,用25mmol/L葡萄糖和25mmol/L甘露醇分别刺激细胞0h、1h、3h、 6h、12h、 24h后收集细胞,检测miR-21的表达量。结果发现,HG可有效刺激Raw264.7细胞miR-21表达上调,而甘露醇高渗刺激巨噬细胞miR-21表达降低。HG刺激巨噬细胞miR-21表达增加上调还随刺激时间的增加而逐渐增加,提示HG刺激巨噬细胞miR-21表达的上调呈时间依赖性。与甘露醇高渗组相比,HG处理细胞1h后miR-21表达开始明显增加(P0.01),6h时miR-21表达达到高峰(P0.01),12h后表达开始降低。2.为了研究HG对Raw264.7细胞中PDCD4 mRNA表达的影响,Raw264.7细胞用葡萄糖和甘露醇分别处理细胞Oh、6h、12h、 24h、48h、72h后,检测PDCD4 mRNA的表达量。结果发现,在12h时HG刺激使Raw264.7细胞PDCD4 mRNA表达量明显下降(P0.05),24h之后其mRNA表达量开始增加(P0.01),而甘露醇在6h时可引起PDCD mRNA显著增加(P0.01),之后对PDCD4的作用不明显。这表明HG对巨噬细胞PDCD4 mRNA表达的影响也刺激时间有关,12h之前降低其表达,之后表达增加。Western Blot进一步证实,HG处理巨噬细胞12h后,PDCD4蛋白表达量亦显著增加。本实验同时发现,HG可引起巨噬细胞PTEN mRNA和蛋白表达在12h内PTEN表达量明显下降(P0.05)。3.为了研究高浓度葡萄糖对巨噬细胞凋亡的影响,Raw264.7细胞分别用HG和甘露醇孵育不用时间后(0h、24h、48h),用裂解细胞提取细胞蛋白质,western blot检测活化caspase-3的蛋白表达量。结果显示,与甘露醇组相比,HG能明显增加活化caspase-3蛋白表达量。HG处理Raw264.7细胞24h后,活化caspase-3蛋白表达量开始明显增加,48h时表达量增加更明显。HG处理Raw264.7细胞0h、24h、48h后,流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡情况。结果表明,与对照组相比,HG组巨噬细胞的凋亡明显增加,且呈时间依赖性。本实验同时发现,随着HG刺激时间的延长,坏死的细胞也逐渐增多。4.本研究应用miR-21抑制剂抑制Raw264.7细胞miR-21的表达后,再检测PDCD4和PTEN的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,miR-21抑制剂巨噬细胞24h后,与对照组相比,miR-21的表达明显降低(P0.01). Real-time PCR结果显示,与对照组相比,Raw264.7细胞转染miR-21抑制剂24h后,其PDCD4 mRNA表达量明显增加(P0.01),这提示miR-21可以抑制PDCD4的表达；HG刺激组PDCD4 mRNA表达明显降低(P0.05),进一步证实了HG能够降低PDCD4的表达。与HG刺激的对照组相比,miR-21抑制剂抑制细胞miR-21表达24h后再加入HG刺激细胞12h后的PDCD4 mRNA表达量也明显增加(P0.05)。与单纯miR-21抑制剂组相比,抑制miR-21的巨噬细胞经HG处理后,其PDCD4的表达明显降低(P0.01)。Western Blot的结果与Real-time PCR结果相同。与对照组相比,HG处理巨噬细胞后其PTEN的表达明显减低(PO.05)；miR-21抑制组的巨噬细胞PTEN含量则明显增加(P0.01)。与HG处理的对照组相比,抑制miR-21的巨噬细胞经HG处理后,其PTEN的表达亦增加(P0.05),与单纯miR-21抑制组性比,其PTEN的表达明显降低(P0.01)。结论1.miR-21在高浓度葡萄糖诱导的Raw264.7巨噬细胞中表达增加,这种表达上调呈时间依赖性。2.miR-21通过调节其靶基因PDCD4对高浓度葡萄糖诱发的巨噬细胞凋亡起保护效应。背景心血管疾病是我国目前人群死亡的首位死亡原因,近年来我国冠心病的发生率及死亡率逐渐上升。研究表明,血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平的升高是冠心病和缺血性脑卒中发生的独立危险因素之一,因此,对高胆固醇血症患者的防治必须给予高度重视。3-羟基-3-甲基戊二^莞窤还原酶抑制剂(HMG-CoA),俗称"他汀类",可通过抑制肝细胞内的胆固醇合成限速酶,降低胆固醇的合成,并通过增加低密度脂蛋白受体的表法来降低循环中低密度脂蛋白的水平。研究表明,患者从他汀类药物的临床获益绝大部分是通过其降脂作用,同时送些药物可在心血管疾病的多方面发挥其非降脂作用,包括改善内膜功能、增强动脉粥样硬化斑块的稳定性、降低氧化应激及炎症反应,抑制血管壁的血拴形成、抑制心肌纤维化等。研究表明高胆固醇血症患者心房纤颤的发生率X椄摺Ｗ笮姆坑写⒋嫫鞴δ堋⒐艿拦δ芗爸Ρ霉δ芩腿龉δ，
本文编号：734097
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/734097.html
教材专著
