5-氨基乙酰丙酸—光动力疗法对食管癌转移的影响及其机制研究

发布时间：2017-08-31 16:42

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【摘要】：恶性肿瘤是以细胞异常增生为特征的常见疾病,早期诊断和及时治疗是降低肿瘤患者死亡率的关键。但恶性肿瘤的早期诊断和有效控制仍是医学界的棘手问题。手术治疗、放射治疗与药物治疗仍是目前治疗恶性肿瘤的常规手段。但这些传统的治疗手段常难以获得理想效果,医学界仍在不断探索治疗肿瘤的新方法。食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,全世界每年大约有30多万人死于食管癌,它的发病率和死亡率各个国家种族之间差异很大。手术治疗、放射治疗和化疗仍是目前治疗食管癌的常规手段,尤其对于晚期的食管癌患者,这些传统的治疗手段常难以获得理想效果,我们仍在不断探索治疗食管癌的新方法。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是随着激光医学发展而兴起的一种治疗肿瘤的新方法。它通过光吸收物质吸收对应波长的激光能量,然后在肿瘤部位产生光物理和光化学反应杀伤肿瘤。二十多年的临床实践医疗中,光动力疗法在恶性肿瘤的治疗中取得了令人瞩目的成就,目前光动力治疗肿瘤已经得到了世界上许多国家的认可,它具有治疗的目标专一,治疗效果显著,对正常组织伤害小等许多优点。光动力疗法应用于恶性肿瘤的治疗已有100多年的历史。1996年美国FDA首先批准PDT用于治疗晚期食管癌,目前已应用到皮肤、头颈部、消化道、肺癌、膀胱、肝脏、宫颈、阴道等部位的恶性肿瘤。光动力疗法的核心是光敏剂,5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)是第二代光敏剂,它是一种内源性光敏剂,它本身不具有光敏活性,在体内是从甘氨酸合成原卟啉Ⅸ (PpⅨ),再转化成亚铁血红素过程中的中间产物。PpⅨ有很强的光敏活性,其最佳吸收波长在635nm,它具有毒性低、代谢快、避光时间短等优势,而且在肿瘤细胞的聚集浓度比周围正常组织高10倍左右。近几年,许多研究光动力疗法的体内和体外试验中发现了凋亡和坏死这两种不同的死亡方式,此外光动力疗法还可刺激细胞内的多种信号通路。EGFR是酪氨酸激酶受体HER家族的重要成员之一,许多研究显示,多种实体肿瘤都存在EGFR高表达或突变,PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK是其重要的下游信号转导通路,这些信号通路的激活与肿瘤细胞增殖、抗凋亡、血管形成、侵袭、转移以及放化疗拮抗等多种恶性生物学行为密切有关。PI3K是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,由调节亚基p85和催化亚基pllO组成。PI3K激活的机制有：活化的EGFR与调节亚基p85结合并将其磷酸化,改变PI3K的蛋白构象,使p85对催化亚基pllO的抑制效应减弱。Akt是分子量约为57ku的丝/苏氨酸蛋白激酶,哺乳动物中的Akt是病毒原癌基因v-Akt的同源物。在人类多种肿瘤中,如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和食管癌等,Akt常显示过表达。蒋虹等研究发现Ⅱ、ⅢIa期无淋巴结转移的高分化食管癌组织AKT蛋白表达低于Ⅲb-Ⅳ期、有淋巴结转移的低分化食管癌,揭示了Akt有促进食管癌细胞侵袭、转移的作用。目前已有多种EGFR靶向药物应用于临床,主要由2类药物：一种是作用于EGFR的细胞膜外区域的抗EGFR单克隆抗体,如西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)等,这类药物在细胞外与EGFR结合后抑制EGFR细胞内的信号通路活化；另一种是EGFR细胞内酪氨酸激酶的小分子抑制剂,如吉非替尼(gefitinib)、厄罗替尼(erlotinib)及拉帕替尼(lapatinib),是EGFR和HER2双靶点拮抗剂,该类药物进入细胞后结合于EGFR的酪氨酸激酶,阻断EGFR信号通路。EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂tyrphostin AG1478,是人工合成的,可特异性抑制EGFR的活化,可竞争性地与ATP位点结合,作用于EGFR的细胞内酪氨酸激酶区,进而阻断EGFR及下游信号传导通路。AG1478通过抑制EGFR活化,阻断PI3K/Akt信号转导通路,从而抑制肿瘤生长。LY294002是第一个人工合成的PI3Kα/δ/β的抑制剂,LY294002使Akt/PKB失活,因此抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。有研究应用PI3K的抑制剂LY294002作用于肺癌细胞株,发现Akt的活性降低,肺癌细胞出现凋亡,生长受到抑制,LY294002联合化疗药物促进化疗药物的敏感性。本课题主要研究光动力疗法对食管癌体内及体外肿瘤生长转移的影响,选用的是第二代光敏剂5-氨基乙酰丙酸(ALA),检测食管癌活细胞在体外和体内经光动力作用后细胞生长转移能力的改变,从细胞和在体水平揭示光动力引起的细胞损伤机制,以及其对EGFR/PI3K/AKT信号通路的调控机制,并创新性联合ALA-PDT和EGFR抑制剂AG1478以及PI3K/AKT抑制剂LY294002后,研究其对食管癌Eca-109细胞生长迁移运动能力的影响及EGFR/PI3K/Akt信号通路基因及蛋白表达的变化。基于揭示机理提高疗效的目的,本课题运用光动力疗法与信号通路小分子抑制剂的联合效应,探讨其内在联系,从而为ALA-PDT和酪氨酸激酶抑制剂联合应用于食管癌的治疗提供理论依据,并期望为临床提供新的光动力治疗的模式,改变光动力治疗肿瘤作用范围有限、容易复发、远期疗效差的缺陷,提高肿瘤治疗效果,这将有利于推动光动力疗法的发展及其在肿瘤治疗中的应用。研究目的：1.不同剂量浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法,对食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用；2.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法,对食管癌Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响；3.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法,对裸鼠食管癌肿瘤生长的抑制作用；4.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力治疗裸鼠后,肿瘤组织内EGFR/PI3K/AKT信号通路中的基因及蛋白表达的变化；5.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法联合不同浓度的EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478对食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用；6.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法联合不同浓度的PI3K/AKT抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用；7.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法联合一定浓度的EGFR抑制剂AG1478对食管癌Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响；8.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法联合一定浓度的PI3K/AKT抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响；9.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法联合一定浓度的EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478对食管癌Eca-109细胞内EGFR/PI3K/AKT信号通路中基因及蛋白表达的影响；10.一定浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法联合一定浓度的PI3K/AKT抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞内EGFR/PI3K/AKT信号通路中基因及蛋白表达的影响。研究内容与方法：第一部分5-氨基乙酰丙酸-光动力疗法对食管癌细胞体外迁移运动能力的影响1.ALA-PDT对食管癌Eca-109细胞生长增殖的抑制作用用MTT法测定不同剂量浓度的ALA光敏剂介导的光动力疗法对食管癌细胞增殖的抑制作用,为后续的实验选用的ALA浓度提供参考。2.ALA-PDT对食管癌Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响用Transwell体外迁移实验验证ALA光敏剂介导的光动力疗法,对食管癌Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响。第二部分5-氨基乙酰丙酸-光动力疗法对荷瘤裸鼠食管癌转移的影响及其机制研究1.负载GFP-Eca-109细胞稳定株的建立将携带GFP的慢病毒转染Eca-109细胞,使用流式细胞仪检测转染效率,并用CELLQUEST软件检测和分析其转染效率,使转染效率达到90%以上,荧光显微镜下观察并拍照。2.荷瘤裸鼠模型建立分别将Eca-109细胞、GFP-Eca-109细胞接种于裸鼠右后臀部皮下,饲养一到1-2周,建立食管癌裸鼠模型,用于后续的实验。3.荧光成像ALA-PDT治疗前、后不同时间对荷瘤裸鼠进行荧光成像,了解肿瘤治疗前后的形态、大小变化及有无转移瘤。4.ALA-PDT对荷瘤裸鼠食管癌肿瘤增殖的抑制作用对荷瘤裸鼠进行ALA-PDT治疗前、后不同时间分别测量肿瘤大小,计算肿瘤体积,检测ALA-PDT治疗对裸鼠食管癌肿瘤生长的抑制作用；5. ALA-PDT对荷瘤裸鼠食管癌肿瘤组织内EGFR/PI3K/AKT信号通路中基因表达的影响。通过荧光定量PCR的方法检测ALA光敏剂介导的光动力治疗裸鼠后,食管癌肿瘤组织中基因表达的变化。6. ALA-PDT对荷瘤裸鼠食管癌肿瘤组织内EGFR/PI3K/AKT信号通路中蛋白表达的影响。通过Western blot的方法检测ALA光敏剂介导的光动力治疗裸鼠后,食管癌肿瘤组织中蛋白表达的变化。第三部分5-氨基乙酰丙酸-光动力疗法联合AG1478和LY294002对食管癌细胞体外迁移运动能力的影响及其机制研究1. ALA-PDT联合AG1478对Eca-109细胞增殖的抑制作用用MTT法检测ALA光敏剂介导的光动力疗法联合不同浓度的EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478对食管癌Eca-109细胞生长的抑制率,并检测不同浓度的EGFR抑制剂AG1478对食管癌Eca-109细胞生长抑制率的变化,选取最佳的与光动力疗法联合的AG1478的浓度剂量。2.ALA-PDT联合LY294002对Eca-109细胞增殖的抑制作用用MTT法检测ALA光敏剂介导的光动力疗法联合不同浓度的PI3K/AKT抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞生长的抑制率,并了解不同浓度的PI3K/AKT抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞生长的抑制率变化,选取最佳的与光动力疗法联合的LY294002的浓度剂量。3.ALA-PDT联合AG1478对Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响通过上述的试验选择与光动力疗法联合的AG1478最佳浓度剂量,用Transwell体外迁移实验验证ALA-PDT联合AG1478对Eca-109体外迁移运动能力的影响。4.ALA-PDT联合LY294002对Eca-109细胞体外迁移运动能力的影响通过上述的试验选择与光动力疗法联合的LY294002最佳浓度剂量,用Transwell体外迁移实验验证ALA-PDT联合LY294002对Eca-109体外迁移运动能力的影响。5. ALA-PDT联合AG1478或LY294002对Eca-109细胞中EGFR及下游基因的影响。通过荧光定量PCR的方法检测ALA-PDT联合AG1478治疗后Eca-109细胞内EGFR/PI3K/AKT通路中相关基因表达的变化；通过荧光定量PCR的方法检测ALA-PDT联合LY294002治疗后Eca-109细胞内EGFR/PI3K/AKT通路中相关基因表达的变化。6.ALA-PDT联合AG1478或LY294002对Eca-109细胞中EGFR及下游蛋白的影响通过Western blot的方法检测ALA-PDT联合AG1478治疗后Eca-109细胞内EGFR/PI3K/AKT通路中相关蛋白表达的变化,并检测ALA-PDT联合LY294002治疗后Eca-109细胞内EGFR/PI3K/AKT通路中相关蛋白表达的变化。统计方法：所有数据采用spss13.0统计软件进行统计分析。实验数据用均数±标准差(mean±sd)表示。不同药物浓度处理细胞组间的抑制率差异分析用单因素方差分析(One-Way ANOVA);实验组与对照组Transwell小室中穿膜细胞数的差异分析用两独立样本t检验(Independent-samples T test),组间差异用单因素方差分析；实验组相对于对照组的基因及蛋白表达差异分析采用单样本t检验(One-sample T test),或独立样本t检验,组间对比采用单因素方差分析；裸鼠肿瘤不同处理组间的瘤体积在不同时间点的差异分析用重复测量方差分析(repeated measured)。以P0.05为差异具有统计学意义。结果：1.在同一光照时间和光剂量强度下,不同浓度的光敏剂ALA介导的光动力疗法对食管癌Eca-109细胞体外生长抑制作用有显著性差异(P0.05),在一定范围内,ALA光敏剂浓度越高,抑制率越高。2.浓度为0.5mmol/L的光敏剂ALA介导的光动力疗法可降低食管癌Eca-109细胞体外迁移运动能力,与对照组差异有显著性(P0.05)。3.携带GFP的裸鼠经光敏剂ALA介导的光动力治疗后,在治疗后8天到36天肿瘤生长受抑制,与空白对照组、携带GFP的不治疗组间有显著性差异(P0.05),而空白对照组与携带GFP的不治疗组间肿瘤体积变化无显著性差异(P0.05)。4.ALA介导的光动力治疗后裸鼠肿瘤组织内EGFR/PI3K/AKT通路中相关基因及蛋白表达下调,提示ALA-PDT可能通过下调该通路中基因及蛋白的表达导致肿瘤生长转移能力下降。5.不同浓度的EGFR抑制剂AG1478对食管癌Eca-109细胞的生长抑制率不同,组间有显著性差异(P0.05),最佳抑制浓度为20ummol/L,0.5mmol/L的ALA-PDT联合不同浓度的AG1478对食管癌Eca-109细胞的生长抑制率不同,组间有显著性差异(P0.05),最佳联合的抑制浓度为20ummol/L。6.不同浓度的PI3K/AKT抑制剂LY294002对食管癌Eca-109细胞的生长抑制率不同,组间有显著性差异(P0.05),最佳抑制浓度为20ummol/L,0.5mmol/L的5-ALA-PDT联合不同浓度的LY294002对食管癌Eca-109细胞的生长抑制率不同,组间有显著性差异(P0.05),最佳联合的抑制浓度为20ummol/L。7.0.5mmol/L的ALA-PDT联合20umol/L的AG1478可降低食管癌细胞体外迁移运动能力,与单纯ALA-PDT和空白对照组间有显著性差异(P0.05)。8.0.5mmol/L的ALA-PDT联合20umol/L的LY294002可降低食管癌细胞体外迁移运动能力,与单纯ALA-PDT和空白对照组间有显著性差异(P0.05)。9.ALA-PDT作用于Eca-109细胞后,细胞中EGFR基因表达显著下调,ALA-PDT联合AG1478作用于Eca-109细胞后,细胞中的EGFR基因及蛋白下调较对照组差异有显著性(P0.05)。10.ALA-PDT联合LY294002作用于Eca-109细胞后,细胞中的AKT基因及蛋白下调,较对照组差异有显著性(P0.05)。结论：本研究首先从体外实验验证了光敏剂ALA介导的光动力疗法可抑制食管癌细胞的生长迁移能力,然后成功构建了携带GFP荷瘤裸鼠模型,以ALA-PDT治疗裸鼠食管癌肿瘤,结果显示,ALA-PDT治疗可降低裸鼠肿瘤的生长速度,并检测了裸鼠食管癌肿瘤组织内EGFR/PI3K/AKT信号通路中的基因及蛋白表达变化,揭示了ALA-PDT降低食管癌的生长转移能力的分子机制。通过体内外的实验,揭示了ALA-PDT可下调EGFR/PI3K/AKT信号通路基因和蛋白的表达,再进一步应用EGFR抑酪氨酸激酶制剂AG1478、PI3K/AKT抑制剂LY294002与ALA-PDT联合作用于Eca-109细胞,发现ALA-PDT分别与两种抑制剂联合后,可进一步下调EGFR/PI3K/AKT信号通路中的相关基因和蛋白的表达,降低食管癌Eca-109细胞体外生长迁移的能力。综上所述,本课题通过阐明ALA介导的光动力疗法对食管癌体内和体外生长转移能力的影响及其调控EGFR/PI3K/AKT信号通路的分子机制,明确了ALA-PDT抗肿瘤的分子机制,并进一步创新性应用新的光动力疗法,即联合应用EGFR/PI3K/AKT信号通路的小分子抑制剂,增强ALA-PDT的杀伤力,有助于推动光动力疗法这一新型肿瘤治疗方法的进展。
【关键词】：5-氨基乙酰丙酸 光动力疗法 食管癌 AG1478 LY294002 EGFR
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-23
• 前言23-31
• 参考文献29-31
• 第一章 5-氨基乙酰丙酸-光动力疗法对食管癌细胞体外迁移运动能力的影响31-46
• 1.1 材料与方法31-38
• 1.2 统计学方法38
• 1.3 结果38-41
• 1.4 结论41
• 1.5 讨论41-43
• 参考文献43-46
• 第二章 5-氨基乙酰丙酸-光动力疗法对荷瘤裸鼠食管癌转移的影响及其机制研究46-81
• 2.1 材料与方法46-62
• 2.2 统计学方法62-63
• 2.3 结果63-76
• 2.4 结论76-77
• 2.5 讨论77-79
• 参考文献79-81
• 第三章 5-氨基乙酰丙酸-光动力疗法联合AG1478和LY294002对食管癌细胞体外迁移运动能力的影响及其机制研究81-113
• 3.1 材料与方法81-99
• 3.2 统计学方法99
• 3.3 结果99-107
• 3.4 结论107-108
• 3.5 讨论108-110
• 参考文献110-113
• 全文小结113-115
• 中英文缩略词表115-116
• 学习期间发表的论文116-117
• 致谢117-120
• 统计学证明120

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本文编号：766742