SEMA3F通过下调ASCL2-CXCR4轴而抑制结直肠癌转移的分子机制

发布时间：2017-09-03 11:04

  本文关键词：SEMA3F通过下调ASCL2-CXCR4轴而抑制结直肠癌转移的分子机制

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【摘要】：结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其致死的主要原因是转移。在没有发生转移的结直肠癌患者中,5年生存率为80-90%;而发生了转移的结直肠癌患者的5年生存率只有10-20%。因此,寻找结直肠癌转移的生物标记和治疗靶点具有重要的科学意义和使用价值。在神经系统发育过程中,神经元轴突需要迁移到全身各个组织和器官,这个过程受到精密的调控。3型神经轴突导向分子家族由分泌型轴突导向分子组成,这些分子能够调节神经轴突的迁移方向。除了在中枢神经系统表达,越来越多的研究表明,包括SEMA3F在内的3型神经轴突导向分子在其它系统也有表达。这些分子在肿瘤血管新生、肿瘤生长以及转移中都有重要作用。鉴于肿瘤转移的过程与神经元轴突迁移的过程具有一定的相似性,课题组前期研究了SEMA3F在结直肠癌中的作用,发现SEMA3F在结直肠癌中低表达,且SEMA3F能够抑制结直肠癌的生长和转移。但是SEMA3F的表达与结直肠癌患者预后的关系,以及SEMA3F抑制结直肠癌转移的机制仍不清。趋化因子受体CXCR4是第一个被证明在肿瘤转移中有关键作用的趋化因子受体。CXCR4促进乳腺癌细胞向肺和骨髓转移,因为CXCR4的配体CXCL12在肺和骨髓中高表达。在被CXCL12激活后,CXCR4能够通过多条信号通路传导趋化、侵袭迁移,增殖和干性信号。阻断CXCR4的功能能够减少结肠癌细胞向肝脏和肺转移。临床研究表明,高表达CXCR4与结直肠癌复发、肝转移正相关。进一步的研究发现,肝脏星形细胞分泌的CXCL12能够促进表达CXCR4的结直肠癌细胞发生肝转移,而CXCR4的抑制剂AMD3100能够显著减少肝转移。ASCL2(Achaete scute-like 2)是一个螺旋-环-螺旋(b HLH)家族转录因子,在通过HLH结构域形成二聚体后,它能够通过自身的碱性结构域与E-box(CANNTG)结合,调节基因转录。ASCL2基因位于11号染色体断臂1区5带5亚带,结直肠癌中这个区域常常发生印迹缺失。以往在消化道肿瘤中进行的研究发现,ASCL2在消化道肿瘤中高表达,并受到WNT信号通路的调节。进一步的研究表明,ASCL2调节消化道干细胞标志物lgr5的表达,并影响消化道干细胞的干性。敲低ascl2能够抑制结直肠癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭。本课题组前期研究发现结直肠癌中sema3f的表达比正常肠上皮细胞低,同时sema3f也抑制结直肠癌细胞的生长和转移。但是sema3f在结直肠癌中的临床预后价值,以及它抑制结直肠癌转移的机制仍不清楚。我们利用免疫组织化学在303例结直肠癌病人标本中检测了sema3f的表达,并用kaplan-meier分析了sema3f的表达与预后的关系。通过rt-pcr,westernblot,免疫荧光、流式细胞检测等方法检测了sema3f对cxcr4表达的影响,并研究了相关分子机制。主要结果和结论:1.低表达sema3f的结直肠癌患者中远处转移、淋巴结转移发生率更高,预后更差51.2%(155/303)的结直肠癌标本中sema3f呈低表达。低表达sema3f与远处转移、复发、tnm分期和淋巴结转移显著相关,但与性别、发生部位、肿瘤大小、分化程度和t分期无显著相关。sema3f在正常肠上皮中高表达,在结直肠癌中表达降低,在淋巴结转移灶中表达更低。kaplan-meier生存分析表明sema3f低表达的患者总体生存时间更短。2.sema3f通过下调cxcr4抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移敲低sema3f后cxcr4的转录和表达都显著增加,而过表达sema3f后cxcr4的转录和表达都显著减少。同时,不管是敲低或过表达cxcr4,还是cxcr4抑制剂amd3100处理,对sema3f的表达都没有影响。敲低和过表达sema3f分别增加和降低细胞侵袭和迁移能力。cxcr4的配体cxcl12增加敲低sema3f的细胞的侵袭和迁移能力,且呈剂量依赖关系。但是cxcl12不能增加过表达sema3f细胞的侵袭和迁移能力。敲低sema3f的细胞中再敲低cxcr4后,细胞侵袭迁移能力显著减少;过表达sema3f的细胞再过表达cxcr4后,细胞侵袭迁移能力显著增加。3.sema3f通过pi3k-akt信号通路下调ascl2-cxcr4轴敲低sema3f后结直肠癌细胞中ascl2的表达上调,而过表达sema3f则下调ascl2的表达。敲低ascl2后,结直肠癌细胞的cxcr4下调,而过表达ascl2则上调cxcr4。荧光素酶报告基因实验表明,ascl2促进结直肠癌细胞中cxcr4的转录。染色质免疫共沉淀实验证实,ascl2能够与cxcr4的启动子区结合。敲低sema3f后akt磷酸化增加,但erk1/2和jnk的磷酸化无明显变化。同样,过表达sema3f减少akt磷酸化,但不影响erk1/2和jnk的磷酸化。pi3k抑制剂LY294002能够显著降低ASCL2和CXCR4的表达,但对SEMA3F的表达没有作用。4.高表达ASCL2的结直肠癌患者的预后更差,且ASCL2促进结直肠癌细胞的侵袭和转移119例结直肠癌患者标本中发现,47.1%(56/119)的标本中ASCL2高表达。ASCL2高表达与远处转移、TNM分期、肿瘤大小和肿瘤部位显著相关。Kaplan-Meier生存分析发现,高表达ASCL2的患者的总体生存时间比低表达的患者更短。敲低ASCL2不仅显著降低结直肠癌细胞的侵袭,同时也降低了CXCL12对肿瘤细胞的趋化作用。相反,过表达ASCL2则显著增强肿瘤细胞的侵袭能力,并增加CXCL12对细胞的趋化作用。裸鼠肝转移模型中,敲低ASCL2显著减少肝转移的发生,而过表达ASCL2则显著增加肝转移。5.抑制CXCR4能够抑制敲低SEMA3F对细胞侵袭和转移的促进作用。虽然CXCR4抑制剂AD3100能同时降低对照组细胞和SEMA3F敲低细胞的侵袭能力,但是高浓度AMD3100(5或10μM)处理下,对照组细胞和SEMA3F敲低细胞的侵袭能力相近。体内实验表明,SEMA3F敲低细胞肝转移发生率更高(100%vs77.8%),肝转移结节数更多(5.0 vs 1.33)。虽然AMD3100显著抑制对照组细胞(1.33到0.33)和SEMA3F敲低细胞(5.0到1.0)肝转移,但是SEMA3F敲低组降幅更大。6.结直肠癌中SEMA3F和CXCR4表达呈负相关。TCGA数据库中229例结直肠癌基因表达分析结果表明,SEMA3F和CXCR4基因表达水平呈负相关。85例人结直肠癌标本的免疫组织化学检测验证了SEMA3F和CXCR4表达呈负相关。SEMA3F阴性/CXCR4阳性的患者生存时间最短,该组患者淋巴结转移和远处转移的发生率都显著高于其它三组。综上所述,结直肠癌中低表达SEMA3F预示更高的远处转移、复发和淋巴结转移发生率以及更短的生存时间。SEMA3F通过PI3K-AKT通路下调ASCL2-CXCR4轴,从而抑制结直肠癌转移。ASCL2能够与CXCR4的启动子区结合,并促进CXCR4的转录。另外,高表达ASCL2的结直肠癌患者的预后更差,且ASCL2促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。
【关键词】：结直肠癌 转移 SEMA3F CXCR4 ASCL2 预后
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 英文缩写一览表4-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-15
• 前言15-17
• 第一章 结直肠癌中SEMA3F的表达及其临床病理学意义17-30
• 1.1 材料与方法18-22
• 1.2 结果22-26
• 1.3 讨论26-29
• 1.4 小结29-30
• 第二章 SEMA3F抑制结直肠癌转移的机制研究30-92
• 2.1 SEMA3F对结直肠癌细胞CXCR4表达的影响31-59
• 2.2 SEMA3F下调CXCR4的分子机制59-74
• 2.3 转录因子ASCL2在结直肠癌转移中的作用及机制研究74-92
• 2.3.1 材料与方法74-82
• 2.3.2 结果82-89
• 2.3.3 讨论89-91
• 2.3.4 小结91-92
• 全文总结92-93
• 参考文献93-113
• 文献综述一 轴突导向分子Semaphorin家族在肿瘤血管生成中的作用及其机制113-121
• 参考文献118-121
• 文献综述二 AKT家族分子在肿瘤增殖和转移中的作用及机制121-137
• 参考文献128-137
• 攻读博士学位期间发表的论文137-138
• 致谢138

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本文编号：784597