SET介导的人乳腺癌细胞生物学行为的体内外研究

发布时间：2017-09-06 16:13

  本文关键词：SET介导的人乳腺癌细胞生物学行为的体内外研究

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【摘要】：背景乳腺癌是女性当中一种常见的恶性肿瘤,近年来,我国乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势,已位居大城市女性恶性肿瘤发病率的首位。乳腺癌是一种全身性疾病,乳腺癌的发生、发展是由多因素、多步骤协同作用的复杂过程,如物理因素、化学因素、基因突变、染色体异常等。生长因子、细胞因子以及激素等生物活性物质参与了乳腺细胞癌变以及转移的过程,这些活性物质介导的信号转导途径发生异常,可引起某些基因的过度扩增,导致正常细胞接受了异常的增殖、分化和生长信号,最终促使细胞发生癌变。尽管乳腺癌的发病率居高不下,死亡率却不断下降,其原因不仅得益于女性乳腺癌筛查和早诊制度的建立,更得益于近年来不断发展的分子生物学技术和综合诊疗规范化水平的提高。乳腺癌的表观遗传学研究主要包括：组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA。组蛋白(histone)是存在于真核生物细胞染色质中的碱性蛋白质,含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸较多。组蛋白有多种修饰形式,包括组蛋白末端的磷酸化、甲基化、泛素化、乙酰化以及糖基化修饰等。DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下,DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基,形成5-甲基胞嘧啶。非编码RNA(microRNA或miRNA)是一段由18-24个核苷酸构成的非编码的单链小分子RNA,具有调节发育时相的作用,普遍存在于动植物体内并参与了生命过程中的一系列重要进程,包括细胞的增殖、分化以及基因表达的调控等。乳腺癌的发生发展涉及到多种信号转导通路,主要有Notch信号转导通路、ER信号转导通路、受体酪氨酸激酶(RTK)介导的信号转导通路及Wnt信号转导通路。Notch信号通路由受体、配体、CSL-DNA结合蛋白3个部分构成。Notch是一个既简单又复杂的信号通路。Notch信号传导的变化将导致肿瘤的发生,其作用在不同组织细胞中有所不同,甚至在同一组织细胞的不同发展阶段其作用也有所差异。ER是类固醇激素受体超家族成员之一,包括经典的ER-α和新发现的ER-β。ER介导的信号通路可调控乳腺的生长发育和细胞增殖。RTK存在于所有多细胞动物中,参与多种细胞活动的调控,尤其是参与细胞的生长与分化。RTK家族又分为多种亚类：EGFR家族、胰岛素受体家族(IGF)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)等,其中EGFR家族是与乳腺癌关系最为密切的生长因子受体。Wnt信号通路不仅参与了早期胚胎中乳腺的发展,而且在其异常激活时导致乳腺癌的发生,进而促进细胞增殖、肿瘤细胞的转移与侵袭、抵抗凋亡,同时还与肿瘤细胞化疗耐药性有关。SET蛋白,1992年因首次在一名叫SE的白血病患者身上发现并鉴定而命名。SET有多个名称,如模板活化因子-1β(TAF-1β)、蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(I2PP2A)、组织相容性白细胞抗原Ⅱ相关蛋白(PHAP Ⅱ)、粒酶A激活的DNA酶活化抑制剂(IGAAD)等,通用名称为SET。SET蛋白具有重要的功能,这源于其高度保守的结构特征及进化机制。SET广泛表达于人类不同组织和细胞系,人的肺脏、脑、胚胎组织、子宫等均可克隆出SET的cDNA,且表达水平相似。SET可以特异高效性的抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性,PP2A是一种重要的肿瘤抑制因子,参与细胞周期、DNA复制、信号转导、细胞分化和细胞恶性转化等多种细胞生物学事件,SET可以通过抑制PP2A,行使并完成多种生物学功能。SET可以通过抑制组蛋白乙酰化,促进一些核受体介导的基因转录。这一抑制过程主要是由于SET与TAF-1α、pp32组成INHAT复合体,进而通过INHAT结构域与组蛋白结合并阻止组蛋白与组蛋白乙酰转移酶结合,从而抑制组蛋白乙酰化。SET蛋白可促进腺病毒DNA复制,在腺病毒基因组的复制过程中,宿主SET通过募集复制必需因子至裸露的DNA和核蛋白复合体上,从而促进DNA复制。SET作为组蛋白分子伴侣,具有核小体装配功能,这一功能在染色质转录过程中起到重要的促进作用。SET参与细胞凋亡,这一过程可能是通过抑制DNA酶NM23-H1的活化和核小体的装配功能而完成的。SET与多种临床疾病相关,在多种肿瘤组织中高表达。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近几年发展起来的新技术,是一种特异、高效、经济的抑制基因表达的手段。RNA干扰技术涉及到dsRNA的酶切,Dicer酶是一种核酶复合体,属于RNAase家族,dsRNA被这种酶切割成小分子RNA(siRNA), siRNA具有干扰同源性靶mRNA分子表达的功能,从而达到靶向基因沉默的目的。作为一种新的实验手段,RNAi技术广泛应用于基因治疗,这项技术的飞速发展极大的促进了人们对功能基因组学等方面的研究,这源于RNAi具有的几个作用特点：序列特异性、高效稳定性、双干扰系统、可传递性和遗传性。为了揭示SET蛋白在乳腺癌中的作用,本课题首先检测了SET蛋白在乳腺癌患者组织中的表达情况,然后检测SET被稳定干扰后对乳腺癌细胞生长与侵移的影响,并进一步通过裸鼠成瘤探讨SET干扰表达后在动物水平上的生物学作用。本研究为更深入的揭示肿瘤发生发展的分子机制提供基础,同时为肿瘤的诊断和治疗提供标记物和治疗靶点。方法一、SET蛋白在临床乳腺癌组织标本中的表达1.免疫印迹(Western-blot)检测组织中SET表达切取适量病人组织样品,液氮研磨后加入蛋白裂解液,充分裂解后离心收取蛋白上清,按试剂盒说明书进行蛋白定量,加入合适比例的上样缓冲液,煮沸变性。蛋白溶液经SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,选取GAPDH作为内参蛋白,加入一抗后4℃C孵育过夜。第二天用TBST洗膜,加二抗后孵育1小时后用TBST洗膜,冷CCD成像系统中曝光成像,用ImageJ软件分析条带的光密度,比较蛋白表达变化。2.免疫组化(IHC)检测组织中SET表达切取适量病人组织样品,4%多聚甲醛中固定组织,梯度乙醇脱水后石蜡包埋组织样品。切取5微米组织切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精再水化,过氧化氢中和组织中的过氧化氢酶,柠檬酸盐缓冲液中加热进行抗原修复,正常山羊血清封闭,加一抗后4℃过夜。第二天按二抗说明书加入加亲合素结合的二抗孵育,DAB染色,苏木精复染细胞核,中性树胶封片,晾干后显微镜下镜检。二、SET稳定缺陷乳腺癌细胞株的构建1.靶向SET基因的shRNA表达载体的构建及鉴定在GENBANK中查找SET的mRNA全序列设计SET特异性siRNA靶序列,BLAST同源分析证实其特异性,合成两条shRNA的DNA模板单链,退火后连接到双酶切后的pLVX-shRNAl载体上,将连接产物转化后进行酶切和序列鉴定,鉴定无误后大量扩增并提取重组质粒。2.慢病毒包装重组质粒选用293T细胞进行慢病毒包装,按照慢病毒包装试剂盒说明书配制各种成分,达到最高峰时收集病毒上清,滴度检测。3.构建SET缺陷型乳腺癌细胞株将病毒液按适当比例与细胞培养基混合后转导目的细胞,嘌呤霉素筛选,共筛选15天。提取细胞蛋白,按试剂盒说明进行蛋白定量,Western-blot检测SET蛋白。提取细胞总RNA,反转录为cDNA,采用RT-PCR测定SET mRNA的表达。三、RNA干扰抑制SET表达对乳腺癌细胞株生物学行为的影响1.MTT法测定细胞生长速度接种每组细胞于96孔板,MTT法绘制细胞标准曲线,确立线性关系。连续7天检测并绘制细胞生长曲线,根据公式计算细胞倍增时间。2.流式细胞术检测细胞凋亡接种每组细胞于6孔板,培养贴壁后收集细胞,按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒处理细胞,上流式细胞仪检测细胞凋亡。3.细胞划痕检测肿瘤细胞迁移接种每组细胞于6孔板,培养贴壁后在6孔板内垂直划线,分别于0h、12h、24h取样观察并拍照细胞向划痕区域的迁移情况。4.细胞侵袭检测培养各组乳腺癌细胞株,采用Transwell小室接种细胞,通过计数穿膜细胞数检测肿瘤细胞侵袭力的变化。四、RNAi沉默SET基因对人乳腺癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的影响1.裸鼠成瘤动物模型的制备将裸鼠随机分组,无菌注射各组乳腺癌细胞株,致瘤成功后每5天测量肿瘤体积,30天后脱颈法处死裸鼠,解剖取出肿瘤组织并称取肿瘤质量。2. Western-blot检测瘤体组织中SET表达切取适量裸鼠成瘤的瘤体组织样品,液氮研磨后加入蛋白裂解液,充分裂解后离心收取蛋白上清,按试剂盒说明书进行蛋白定量,加入合适比例的上样缓冲液,煮沸变性。蛋白溶液经SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,选取GAPDH作为内参蛋白,加入一抗后4℃孵育过夜。第二天用TBST洗膜,加二抗后孵育1小时后用TBST洗膜,冷CCD成像系统中曝光成像,用ImageJ软件分析条带的光密度,比较蛋白表达变化。3.IHC检测瘤体组织中SET表达切取适量裸鼠成瘤的瘤体组织样品,4%多聚甲醛中固定组织,梯度乙醇脱水后石蜡包埋组织样品。切取5微米组织切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精再水化,过氧化氢中和组织中的过氧化氢酶,柠檬酸盐缓冲液中加热进行抗原修复,正常山羊血清封闭,加一抗后4℃过夜。第二天按二抗说明书加入加亲合素结合的二抗孵育,DAB染色,苏木精复染细胞核,中性树胶封片,晾干后显微镜下镜检。五、统计学分析用SPSS13.0软件进行统计学分析,数据结果以±S表示,根据实验设计对各组之间进行单因素方差分析、析因设计的方差分析并进行了方差齐性检验,采用了重复测量的方差分析,并进行了球形检验,以p0.05为方差齐性及满足球形检验,之后采用基于方差分析的多重比较方法,p0.05为有统计学意义。对吸光度和细胞数量进行直线拟合,并进行线性回归分析。结果一、SET蛋白在临床乳腺癌组织标本中的表达经液氮研磨法提取乳腺癌病例组织蛋白,进行Western-blot检测SET在组织中的表达情况,可以看出SET蛋白在癌旁组织与癌组织中的表达均高于其正常乳腺组织,差异具有统计学意义p0.001)。免疫组化结果显示SET在乳腺细胞胞核胞浆内均有表达,在癌组织、癌旁组织中呈现大量棕黄色颗粒,而在正常乳腺组织中,只有少量浅黄色颗粒。二、SET稳定缺陷乳腺癌细胞株的构建1.成功构建靶向SET基因的shRNA表达载体设计出针对SET的siRNA,将退火后的双链寡核苷酸片段克隆到pLVX-shRNAl载体,经过阳性菌落酶切鉴定与测序,结果正确。2.慢病毒上清滴度检测293T细胞包装慢病毒,达到最高峰时收集病毒上清,滴度检测显示病毒液滴度在5×106-5×107之间,滴度较高。3.成功构建SET缺陷型乳腺癌细胞株与未转染的对照组乳腺癌细胞株相比,携带SET基因干扰片段shRNA病毒转导两种乳腺癌细胞株后,SET蛋白的表达明显受到抑制,差异具有统计学意义(p0.001)。Western-blot与RT-PCR检测结果一致。三、RNA干扰抑制SET表达对乳腺癌细胞株生物学行为的影响1.细胞生长速度MTT法绘制细胞标准曲线,线性关系良好。连续7天绘制细胞生长曲线,psiRNA-SET缺陷组细胞生长均变得缓慢,生长曲线较平缓。根据公式计算出细胞倍增时间,发现SET缺陷组细胞的倍增时间延长。2.细胞凋亡与对照组细胞的凋亡情况相比,psiRNA-SET缺陷组细胞的凋亡率明显升高,差异具有统计学意义p0.001)。3.细胞划痕检测肿瘤细胞迁移测量划痕宽度并经公式计算后得出细胞的迁移率,结果显示在两种乳腺癌细胞中,psiRNA-SET缺陷组细胞的迁移率均低于其对照组,差异具有统计学意义(p0.001)。4.细胞侵袭检测每种乳腺癌细胞株的对照组和pLVX空白质粒对照组的穿膜细胞数无明显区别,而psiRNA-SET组穿膜细胞数明显低于其他两组培养各组乳腺癌细胞株,差异具有统计学意义(p0.001)。四、RNAi沉默SET基因对人乳腺癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的影响1.成瘤及生长接种乳腺癌肿瘤细胞后,所有裸鼠在实验过程中存活状态良好,均无意外死亡。绘制各组裸鼠的肿瘤生长曲线显示,psiRNA-SET细胞组种植瘤生长速度显著低于其对照组及pLVX空白质粒组细胞。30天后处死裸鼠,剥离种植瘤称重,发现psiRNA-SET细胞组的种植瘤重量均明显低于其对照组,差异具有统计学意义p0.001)。2.SET在瘤体组织中的表达经液氮研磨法提取各组种植瘤瘤体组织蛋白,进行Western-blot检测SET在组织中的表达情况,可以看出psiRNA-SET细胞组的种植瘤中SET蛋白的表达低于对照组,免疫组化结果与此一致。结论1.本研究结果表明,SET蛋白在乳腺癌癌旁组织及癌变组织中的表达明显高于在正常乳腺组织中的表达。2.本研究成功构建了稳定干扰SET乳腺癌细胞株,为后续实验提供了模式细胞株。3.本研究结果表明,SET缺陷表达后可在一定程度上抑制乳腺癌细胞的增殖,促进癌细胞的凋亡,并可以明显抑制肿瘤细胞的侵袭与转移。4.本研究结果显示,稳定干扰SET的表达后,在一定程度上抑制了肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力,并且在裸鼠体内能够维持SET的低表达。
【关键词】：乳腺癌 SET RNAi 转移 侵袭 裸鼠成瘤
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-29
• 材料与方法29-58
• 1 材料29-36
• 1.1 临床样品来源29
• 1.2 细胞、菌株及质粒29-30
• 1.3 实验动物30
• 1.4 主要试剂30-32
• 1.5 主要仪器32-34
• 1.6 主要试剂配制34-36
• 2 方法36-58
• 2.1 SET蛋白在临床乳腺癌组织样品中的表达36-41
• 2.2 SET稳定缺陷乳腺癌细胞株的构建41-52
• 2.3 RNA干扰抑制SET表达对人乳腺癌细胞株生物学行为的影响52-55
• 2.4 RNAi沉默SET基因对人乳腺癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的影响55-57
• 2.5 统计学分析57-58
• 结果58-84
• 1 SET蛋白在乳腺癌组织中表达的情况58-60
• 1.1 Western-blot检测SET蛋白在乳腺癌组织中表达的情况58-59
• 1.2 免疫组化检测SET蛋白在乳腺癌组织中表达的情况59-60
• 2 SET稳定缺陷乳腺癌细胞株的构建60-68
• 2.1 psiRNA重组质粒的测序鉴定60-61
• 2.2 病毒滴度检测61-62
• 2.3 puromycin最佳浓度的确定及细胞筛选62
• 2.4 实时荧光定量检测SET基因表达62-67
• 2.5 Western-blot分析SET蛋白表达67-68
• 3 RNA干扰抑制SET表达对乳腺癌细胞株生物学行为的影响68-77
• 3.1 MTT法检测细胞生长68-72
• 3.2 流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡72-73
• 3.3 划痕实验检测肿瘤细胞迁移73-75
• 3.4 Transwell侵袭小室检测细胞侵袭能力75-77
• 4 RNAi沉默SET基因对人乳腺癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的影响77-84
• 4.1 psiRNA-SET对裸鼠成瘤的影响77-81
• 4.2 免疫印迹结果81-82
• 4.3 免疫组化结果82-84
• 讨论84-93
• 全文结论93-94
• 综述94-107
• 参考文献107-120
• 攻读学位期间成果120-121
• 致谢121-124
• 统计学证明124

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本文编号：804124